1 、产品介绍
ee-SANUPharoseFF 是将基因工程改造的链霉亲和素(Streptavidin ,SA)和纽龙生 物 NUPharose 琼脂糖凝胶偶联而成的亲和层析分离介质。ee 意为易洗脱(easy elution), 即可以温和洗脱结合在介质上的生物素化物质,如生物素化抗原、生物素化抗体、生物 素化蛋白、生物素化核酸等,可用于 Avi-Tag 融合表达的生物素化蛋白的纯化、经过标 记反应后的生物素化和非生物素化物质的分离、生物素化抗原抗体固定化和重复回收利 用等。
纽龙生物还有另一款链霉亲和素填料 Streptavidin NUPharose FF ,由于链霉亲和素 与生物素的超强亲和力,温和常用的方法不能将生物素标记物质洗脱。ee-SA 配基经过 分子层面的设计改造,大幅降低了与生物素的亲和力,同时保持了与生物素的特异性。 结合在 ee-SA NUPharose FF 填料上的生物素化物质可通过含 D-生物素的缓冲液竞争洗 脱,该洗脱方式温和,一般不会影响目标物的活性,洗脱液中的 D-生物素可通过换液方 式去除。因而通过 ee-SANUPharoseFF 的一步层析就可获得有活性、高纯度的生物素化 物质。
2 、产品特点与技术指标
产品名称 | ee-SANUPharose FF |
目录编号 | NRPB60L 、NRPB60S(预装柱) |
基质 | 4%交联琼脂糖 |
配基 | ee-SA(易洗脱链霉亲和素) , ≥6mg/mL |
粒径范围 a | 45~165 μm |
平均粒径 | ~90 μm |
载量 b | 3~6 mg/mL(生物素化 BSA) |
推荐工作流速 | ~150 cm/h(平衡与洗脱),15~100 cm/h(结合) |
最大流速与压力 c | >900 cm/h |
使用 pH | 4~10(推荐的工作 pH),3~13(再生) |
储存与运输 | 20%乙醇,2~8 ℃保存,2~30 ℃运输 |
保质期 | 3 年 |
注:a90%体积以上的微球在此粒径范围;bDBC10%测试条件为:D-生物素标记 BSA ,10%流穿,
6 min 停留时间;c 10 cm 柱高下的最大测试流速。
3 、易洗脱链霉亲和素填料应用原理简介
链霉亲和素与 D-生物素之间的亲和力非常高,其解离常数在 10−14 mol/L 数量级, 是自然界最强的非共价相互作用之一。因而常规的 Streptavidin NUPharose FF 填料与生 物素标记物质结合后,需要在变性条件下洗脱。在该使用方式下,样品易失活,填料的 性能也受影响。
ee-SANUPharoseFF 填料上的ee-SA 配基经过基因工程改造后,保持了与生物素的 特异性的同时,削弱了亲和力,因而可通过 D-生物素竞争洗脱(图 1),扩展了链霉亲 和素填料的应用范围。图 2 为 ee-SANUPharoseFF 纯化生物素化物质的过程,包含特异 性结合、D-生物素竞争洗脱、NaOH 再生等环节。
4 、使用方法参考
4.1 色谱柱装填
以下阐述与层析系统连接时,填料的色谱柱装填方法。
(1)所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样,液体最好做脱气处理。
(2)填料用量计算:通过沉降定量填料体积,需要的沉降填料体积=柱体积×压缩 比(也称压缩因子)。沉降体积是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的稳定 体积。ee-SANUPharoseFF 的压缩比为 1.15。为使达到装柱比,可通过柱头下压的方法, 也可以通过高流速压柱。
(3)填料清洗:将填料悬液充分摇匀后量取相应体积,抽滤除去液体,并用约 3 倍 填料体积的纯化水洗涤,重复 3 次,以除去保存液。
(4)装柱填料悬液准备:将填料转移到适当的容器中,加入适量的装柱液,制成 50~75 v%的装柱填料悬液,使用前搅匀。
(5)装填前准备:在清洗干净的层析柱下端加入装柱液,以除去下垫片及层析柱下 端的空气,在柱内保留少量的蒸馏水,拧紧下堵头,调整柱子使其垂直于地面。
(6)装填:将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内(必要时使用装柱器), 为避免引入气泡,应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后, 用装柱液将装柱 器加满,拧紧装柱器上盖,将柱子与层析系统连接。
(7)压柱:使柱内填料自然沉降(或 50~150 cm/h 的低流速下沉降),待填料沉降 完全后(填料与液体的界面清晰),去除装柱器,装上上柱头,并将柱头下降至界面处; 通过高流速(推荐流速见下表,注意柱压不超过 0.3 MPa),继续压柱至界面清晰稳定, 标记界面稳定时的柱高。停泵, 打开柱头上的阀门/堵头,关闭柱底的阀门/堵头,下压柱 头至标记位置下方与压缩比对应的位置,旋紧柱头,装柱完成。装柱完成后, 需用高流 速平衡柱内的填料。
装柱条件 | ee-SANUPharose FF |
压缩比 | 1.15 |
装柱流速 | 300~600 cm/h |
4.2 柱效测定和评价
完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用 理论塔板高度(HETP)和非对称因子(As)来评价。
4.3 平衡与上样
(1)缓冲液选择:一般选用 pH 6~8 的结合缓冲液,常用缓冲液有 10~100 mM 磷 酸钠缓冲液、20~200 mM Tris-HCl 缓冲液等,根据样品的稳定性,也可添加其他成分, 如 NaCl、还原剂、螯合剂等。若不确定最合适的缓冲体系,在初次使用 ee-SANUPharose FF 时,推荐使用 20mM PBS(20 mM NaH2PO4 ,0.15 M NaCl,调节 pH 7.4)或 20 mM Tris-HCl ,0.15M NaCl ,pH8.0 作为结合缓冲液。
(2)样品处理:样品的缓冲液应与所选结合缓冲液一致。为保证缓冲液一致,可以 在结合缓冲液中破碎细菌、或调解 pH 与结合缓冲液一致、或交换至结合缓冲液(常用 方法有透析、超滤、脱盐柱换液等)、或用结合缓冲液稀释 2~10 倍等。样品上柱前应 0.45 μm 过滤。
(3)平衡:用结合缓冲液平衡 5 个柱体积,建议流速为~150 cm/h
(4)上样流速:推荐线性流速20~100 cm/h 。较小的流速有利于载量的提高,可根 据实际结合情况选择流速,能获得较好的效果。
(5)再平衡:上样后用结合缓冲液再平衡 5~10 个柱体积,或平衡至基线,洗去杂 质,推荐流速为~150 cm/h。
4.3 洗脱
结合了生物素化物质的 ee-SANUPharoseFF 可采用温和的方式洗脱,一般在结合缓 冲液中加入 1-10 mM 的 D-生物素作为洗脱缓冲液,通过竞争的方法洗脱。
4.4 再生
(1)填料使用后需要再生,本产品耐受一定的碱性,推荐使用2~5 个柱体积的 20-
100 mM NaOH 溶液反向清洗柱子,进行再生,推荐流速为~150 cm/h。
(2)其他方法,比如 1-2M NaCl 、70%乙醇、30%异丙醇等,也可用于该介质的再 生。
4.5 填料保存
填料的初始保存液为 20%乙醇,使用过后可继续用20%乙醇保存。保存温度在 2~8℃ 为宜,不可冻存。