4 、使用方法参考

4.1  色谱柱装填

以下阐述与层析系统连接时，填料的色谱柱装填方法。

（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体最好做脱气处理。

（2）填料用量计算：通过沉降定量填料体积，需要的沉降填料体积=柱体积×压缩 比（也称压缩因子）。沉降体积是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的稳定 体积。ee-SANUPharoseFF 的压缩比为 1.15。为使达到装柱比，可通过柱头下压的方法， 也可以通过高流速压柱。

（3）填料清洗：将填料悬液充分摇匀后量取相应体积，抽滤除去液体，并用约 3 倍 填料体积的纯化水洗涤，重复 3 次，以除去保存液。

（4）装柱填料悬液准备：将填料转移到适当的容器中，加入适量的装柱液，制成 50~75 v%的装柱填料悬液，使用前搅匀。

（5）装填前准备：在清洗干净的层析柱下端加入装柱液，以除去下垫片及层析柱下 端的空气，在柱内保留少量的蒸馏水，拧紧下堵头，调整柱子使其垂直于地面。

（6）装填：将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内（必要时使用装柱器）， 为避免引入气泡，应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后， 用装柱液将装柱 器加满，拧紧装柱器上盖，将柱子与层析系统连接。

（7）压柱：使柱内填料自然沉降（或 50~150 cm/h 的低流速下沉降），待填料沉降 完全后（填料与液体的界面清晰），去除装柱器，装上上柱头，并将柱头下降至界面处； 通过高流速（推荐流速见下表，注意柱压不超过 0.3 MPa），继续压柱至界面清晰稳定， 标记界面稳定时的柱高。停泵， 打开柱头上的阀门/堵头，关闭柱底的阀门/堵头，下压柱 头至标记位置下方与压缩比对应的位置，旋紧柱头，装柱完成。装柱完成后， 需用高流 速平衡柱内的填料。

4.2  柱效测定和评价

完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用 理论塔板高度（HETP）和非对称因子（As）来评价。

4.3  平衡与上样

（1）缓冲液选择：一般选用 pH 6~8 的结合缓冲液，常用缓冲液有 10~100 mM 磷 酸钠缓冲液、20~200 mM Tris-HCl 缓冲液等，根据样品的稳定性，也可添加其他成分， 如 NaCl、还原剂、螯合剂等。若不确定最合适的缓冲体系，在初次使用 ee-SANUPharose  FF 时，推荐使用 20mM PBS（20 mM NaH2PO4 ，0.15 M NaCl，调节 pH 7.4）或 20 mM  Tris-HCl ，0.15M NaCl ，pH8.0 作为结合缓冲液。

（2）样品处理：样品的缓冲液应与所选结合缓冲液一致。为保证缓冲液一致，可以 在结合缓冲液中破碎细菌、或调解 pH 与结合缓冲液一致、或交换至结合缓冲液（常用 方法有透析、超滤、脱盐柱换液等）、或用结合缓冲液稀释 2~10 倍等。样品上柱前应 0.45 μm 过滤。

（3）平衡：用结合缓冲液平衡 5 个柱体积，建议流速为~150 cm/h

（4）上样流速：推荐线性流速20~100 cm/h 。较小的流速有利于载量的提高，可根 据实际结合情况选择流速，能获得较好的效果。

（5）再平衡：上样后用结合缓冲液再平衡 5~10 个柱体积，或平衡至基线，洗去杂 质，推荐流速为~150 cm/h。

4.3  洗脱

结合了生物素化物质的 ee-SANUPharoseFF 可采用温和的方式洗脱，一般在结合缓 冲液中加入 1-10 mM 的 D-生物素作为洗脱缓冲液，通过竞争的方法洗脱。

4.4  再生

（1）填料使用后需要再生，本产品耐受一定的碱性，推荐使用2~5 个柱体积的 20-

100 mM NaOH 溶液反向清洗柱子，进行再生，推荐流速为~150 cm/h。

（2）其他方法，比如 1-2M NaCl 、70%乙醇、30%异丙醇等，也可用于该介质的再 生。

4.5  填料保存

填料的初始保存液为 20%乙醇，使用过后可继续用20%乙醇保存。保存温度在 2~8℃ 为宜，不可冻存。