1 、产品介绍
NRPB56 Glutathione NUPharose 4B & NRPB08 Glutathione NUPharose FF——GST标签亲和填料
Glutathione NUPharose 4B 和 Glutathione NUPharose FF 是 GST 标签亲和填料,主要用于谷胱甘肽-S-转移酶标记蛋白(GST 融合蛋白)、谷胱甘肽-S-转移酶和谷胱甘肽 依赖蛋白的分离纯化,通过一步亲和层析,就能获得高纯度的蛋白。
Glutathione NUPharose 4B 基球交联度低、配基密度高,对谷胱甘肽-S-转移酶(28 kDa)的动态结合载量可达 25 mg/ml;Glutathione NUPharose FF 交联度更高、配基密 度相对低,对谷胱甘肽-S-转移酶(28 kDa)的动态结合载量大于 10 mg/ml ,更适合放 大生产。
2 、产品特点与技术指标
产品名称 | Glutathione NUPharose 4B | Glutathione NUPharose FF |
目录编号 | NRPB56L 、NRPB56S(预装柱) | NRPB08L 、NRPB08S(预装柱) |
基质 | 琼脂糖凝胶微球 | 4%交联琼脂糖 |
配基 | 谷胱甘肽,~ 10 μmol/mL | 谷胱甘肽,~8 μmol/mL |
粒径范围 a | 45~ 165 μm | |
平均粒径 | ~90 μm | |
结合量 b | ~25 mg GST-SUMO/mL | ~ 15 mg GST-SUMO/mL |
推荐工作流速 | 60~ 150 cm/h | |
最大流速与压力 | 300 cm/h ,0.3 MPa | 900 cm/h ,0.3 MPa |
pH 稳定性 | 3-12 | |
化学稳定性 | 在以下溶液中稳定:常用的水相缓冲液、1 mol/L 乙酸(pH4.0)、6 mol/L 盐酸 胍、70%乙醇。 | |
储存与运输 | 20%乙醇,2~30 ℃ | |
保质期 | 3 年 |
注:a90%体积以上的微球在此粒径范围;b 测试结果为单位体积填料纯化菌体获得的纯蛋白量, 该结果与 DBC10%结果相当。
3 、GST 标签亲和层析
Glutathione NUPharose 4B 和 Glutathione NUPharose FF 的结构如图 1a 所示, 由 NUPharose 基球、独特设计的多原子间隔臂和谷胱甘肽构成。谷胱甘肽-S-转移酶(GST) 标签蛋白存在谷胱甘肽结合位点(图 1b),可以与填料上的还原型谷胱甘肽配基特异 性结合,结合后可在还原型谷胱甘肽作用下解离,从而达到分离纯化的目的。
4 、使用方法参考
4.1 色谱柱装填
以下阐述与层析系统连接时,填料的色谱柱装填方法。Glutathione NUPharose 4B 更多以重力柱、中压预装柱的形式使用。以下主要阐述 Glutathione NUPharose FF 的装 填方式。
(1)所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样,液体最好做脱气处理。
(2)填料用量计算:通过沉降定量填料体积,需要的沉降填料体积=柱体积×压 缩比(也称压缩因子)。沉降体积是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的 稳定体积。Glutathione NUPharose FF 的压缩比为 1.15。为使达到装柱比,可通过柱头 下压的方法,也可以通过高流速压柱。
(3)填料清洗:将填料悬液充分摇匀后量取相应体积,抽滤除去液体,并用约 3 倍填料体积的纯化水洗涤,重复 3 次,以除去保存液。
(4)装柱填料悬液准备:将填料转移到适当的容器中,加入适量的装柱液,制成50~75 v%的装柱填料悬液,使用前搅匀。
(5)装填前准备:在清洗干净的层析柱下端加入装柱液,以除去下垫片及层析柱 下端的空气,在柱内保留少量的蒸馏水,拧紧下堵头,调整柱子使其垂直于地面。
(6)装填:将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内(必要时使用装柱器), 为避免引入气泡,应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后,用装柱液将装 柱器加满,拧紧装柱器上盖,将柱子与层析系统连接。
(7)压柱:使柱内填料自然沉降(或 50~ 150 cm/h 的低流速下沉降),待填料沉 降完全后(填料与液体的界面清晰),去除装柱器,装上上柱头,并将柱头下降至界面 处;通过高流速(推荐流速见下表,注意柱压不超过 0.3 MPa),继续压柱至界面清晰 稳定,标记界面稳定时的柱高。停泵,打开柱头上的阀门/堵头,关闭柱底的阀门/堵 头,下压柱头至标记位置下方与压缩比对应的位置,旋紧柱头,装柱完成。装柱完成 后,需用高流速平衡柱内的填料。
装柱条件 | Glutathione NUPharose FF |
压缩比 | 1.15 |
装柱流速 | 600 cm/h |
4.2 柱效测定和评价
完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常 用理论塔板高度(HETP)和非对称因子(As)来评价。
4.3 平衡与上样(Equilibration & Loading)
Glutathione NUPharose FF 填料的工作 pH 范围为 6.5~8 ,推荐下述缓冲液 A 为平 衡与上样缓冲液。样品需作澄清处理,并用缓冲液 A 稀释或者换液成缓冲液 A。平衡 缓冲液和洗脱液可含有 1~ 10 mM DTT。
缓冲液A:PBS,140 mM NaCl + 2.7 mM KCl + 10 mM Na2HPO4 + 1.8 mM KH2PO4, pH 7.3。
平衡 5 个柱体积,建议流速为~ 150 cm/h;上样流速为 30~ 150cm/h ,较小的流速 有利于载量的提高,可根据实际结合情况选择流速,能获得较好的效果。
4.4 再平衡
上样后用缓冲液 A 再平衡 5~ 10 CV ,或平衡至基线,洗去杂质,推荐流速为~ 150 cm/h。
4.5 洗脱(Elution)
推荐含 10 mM 还原型谷胱甘肽作为洗脱缓冲液,如下述的缓冲液 B。 缓冲液 B :50 mM Tris-HCl, 10 mM reduced glutathione, pH 8.0。
用洗脱缓冲液洗 6-10 CV ,建议流速为~ 150 cm/h。
4.6 在位清洗(CIP)
通常上述的再生过程可将填料彻底清洗。若发生柱压升高,或为了避免交叉污染, 将金属离子剥离后可进行在位清洗过程。可采用以下溶剂进行在位清洗:、70%乙醇等。 在位清洗可有效去除介质上的杂质,反向效果更佳。清洗后需用 3~5 柱体积的纯水除 去上述溶剂。
4.7 填料保存
填料的初始保存液为 20%乙醇,使用过后可继续用 20%乙醇保存。保存温度在 2~30 ℃为宜,不可冻存。