4 、使用方法参考

4.1  色谱柱装填

以下阐述与层析系统连接时，填料的色谱柱装填方法。Glutathione NUPharose 4B 更多以重力柱、中压预装柱的形式使用。以下主要阐述 Glutathione NUPharose FF 的装 填方式。

（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体最好做脱气处理。

（2）填料用量计算：通过沉降定量填料体积，需要的沉降填料体积=柱体积×压 缩比（也称压缩因子）。沉降体积是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的 稳定体积。Glutathione NUPharose FF 的压缩比为 1.15。为使达到装柱比，可通过柱头 下压的方法，也可以通过高流速压柱。

（3）填料清洗：将填料悬液充分摇匀后量取相应体积，抽滤除去液体，并用约 3 倍填料体积的纯化水洗涤，重复 3 次，以除去保存液。

（4）装柱填料悬液准备：将填料转移到适当的容器中，加入适量的装柱液，制成50~75 v%的装柱填料悬液，使用前搅匀。

（5）装填前准备：在清洗干净的层析柱下端加入装柱液，以除去下垫片及层析柱 下端的空气，在柱内保留少量的蒸馏水，拧紧下堵头，调整柱子使其垂直于地面。

（6）装填：将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内（必要时使用装柱器）， 为避免引入气泡，应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后，用装柱液将装 柱器加满，拧紧装柱器上盖，将柱子与层析系统连接。

    （7）压柱：使柱内填料自然沉降（或 50~ 150 cm/h 的低流速下沉降），待填料沉 降完全后（填料与液体的界面清晰），去除装柱器，装上上柱头，并将柱头下降至界面 处；通过高流速（推荐流速见下表，注意柱压不超过 0.3 MPa），继续压柱至界面清晰 稳定，标记界面稳定时的柱高。停泵，打开柱头上的阀门/堵头，关闭柱底的阀门/堵 头，下压柱头至标记位置下方与压缩比对应的位置，旋紧柱头，装柱完成。装柱完成 后，需用高流速平衡柱内的填料。

4.2  柱效测定和评价

完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常 用理论塔板高度（HETP）和非对称因子（As）来评价。

4.3  平衡与上样（Equilibration & Loading）

Glutathione NUPharose FF 填料的工作 pH 范围为 6.5~8 ，推荐下述缓冲液 A 为平 衡与上样缓冲液。样品需作澄清处理，并用缓冲液 A 稀释或者换液成缓冲液 A。平衡 缓冲液和洗脱液可含有 1~ 10 mM DTT。

缓冲液A：PBS，140 mM NaCl + 2.7 mM KCl + 10 mM Na2HPO4  + 1.8 mM KH2PO4， pH 7.3。

平衡 5 个柱体积，建议流速为~ 150 cm/h；上样流速为 30~ 150cm/h ，较小的流速 有利于载量的提高，可根据实际结合情况选择流速，能获得较好的效果。

4.4  再平衡

上样后用缓冲液 A 再平衡 5~ 10 CV ，或平衡至基线，洗去杂质，推荐流速为~ 150 cm/h。

4.5  洗脱（Elution）

推荐含 10 mM 还原型谷胱甘肽作为洗脱缓冲液，如下述的缓冲液 B。 缓冲液 B ：50 mM Tris-HCl, 10 mM reduced glutathione, pH 8.0。

用洗脱缓冲液洗 6-10 CV ，建议流速为~ 150 cm/h。

4.6  在位清洗（CIP）

通常上述的再生过程可将填料彻底清洗。若发生柱压升高，或为了避免交叉污染， 将金属离子剥离后可进行在位清洗过程。可采用以下溶剂进行在位清洗：、70%乙醇等。 在位清洗可有效去除介质上的杂质，反向效果更佳。清洗后需用 3~5  柱体积的纯水除 去上述溶剂。

4.7  填料保存

填料的初始保存液为 20%乙醇，使用过后可继续用 20%乙醇保存。保存温度在 2~30 ℃为宜，不可冻存。