1 、产品介绍
Biotin NUPharose FF 是一种将D-生物素键合在NUPharose 琼脂糖基球上形成的亲 和层析分离介质。该介质中的生物素配基能高度特异性结合亲和素、链霉亲和素,亲 和力非常高,可用于亲和素、链霉亲和素及其偶联物的固定化,固定化后的产品可应 用于诊断检测,蛋白纯化等。也可直接用于削弱亲和力的亲和素、链霉亲和素突变体 的纯化。
2 、产品特点与技术指标
产品名称 | Biotin NUPharose FF |
目录编号 | NRPB44L 、NRPB44S(预装柱) |
基质 | 6%交联琼脂糖 |
配基 | D-生物素, ≥5 μmol/mL |
粒径范围 a | 45~ 165 μm |
平均粒径 | ~90 μm |
动态结合载量 b | ~30 mg 链霉亲和素突变体/mL 介质 |
推荐工作流速 | 60~ 150 cm/h |
最大流速与压力 | >900 cm/h ,0.3 MPa |
使用 pH | 3~ 12(推荐的工作 pH),3~ 13(CIP 清洗) |
化学稳定性 | 在以下溶液中稳定:常用的水相缓冲液、0. 1 mol/L NaOH 、8 mol/L 尿素、 2%吐温 20 等。 |
储存与运输 | 20%乙醇,2~8 ℃(储存),2~30 ℃(运输) |
保质期 | 3 年 |
注:a90%体积以上的微球在此粒径范围;bDBC10%测试条件为:10%流穿,6 min 停留时间。
3 、生物素填料亲和原理
Biotin NUPharose FF 填料是在NUPharose 琼脂糖凝胶微球骨架上修饰D-生物素而 成(图 1a)。D-生物素与链霉亲和素之间的亲和力非常高,其解离常数在 10−14 mol/L 数量级,是自然界最强的非共价相互作用之一。
本产品特异性结合链霉亲和素后非常稳定,只有在苛刻的条件下,例如 2%SDS的变性条件才能将链霉亲和素解离。因此 Biotin NUPharose FF 适用于亲和素、链霉亲 和素及其偶联物的固定化,固定化后的产品可应用于诊断检测、蛋白纯化等。
另外一方面,一些链霉亲和素的突变体与 D-生物素之间的亲和力大幅减弱,使得 突变体与 D-生物素的特异性结合是可逆的(图 1c),因而可以用 Biotin NUPharose FF 来纯化链霉亲和素突变体(图2)。
4 、使用方法参考
4.1 色谱柱装填
以下阐述与层析系统连接时,填料的色谱柱装填方法。
(1)所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样,液体最好做脱气处理。
(2)填料用量计算:通过沉降定量填料体积,需要的沉降填料体积=柱体积×压 缩比(也称压缩因子)。沉降体积是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的 稳定体积。Biotin NUPharose FF 的压缩比为 1.15 。为使达到装柱比,可通过柱头下压 的方法,也可以通过高流速压柱。
(3)填料清洗:将填料悬液充分摇匀后量取相应体积,抽滤除去液体,并用约 3 倍填料体积的纯化水洗涤,重复 3 次,以除去保存液。
(4)装柱填料悬液准备:将填料转移到适当的容器中,加入适量的装柱液,制成 50~75 v%的装柱填料悬液,使用前搅匀。
(5)装填前准备:在清洗干净的层析柱下端加入装柱液,以除去下垫片及层析柱 下端的空气,在柱内保留少量的蒸馏水,拧紧下堵头,调整柱子使其垂直于地面。
(6)装填:将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内(必要时使用装柱器), 为避免引入气泡,应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后,用装柱液将装 柱器加满,拧紧装柱器上盖,将柱子与层析系统连接。
(7)压柱:使柱内填料自然沉降(或 50~ 150 cm/h 的低流速下沉降),待填料沉 降完全后(填料与液体的界面清晰),去除装柱器,装上上柱头,并将柱头下降至界面 处;通过高流速(推荐流速见下表,注意柱压不超过 0.3 MPa),继续压柱至界面清晰 稳定,标记界面稳定时的柱高。停泵,打开柱头上的阀门/堵头,关闭柱底的阀门/堵 头,下压柱头至标记位置下方与压缩比对应的位置,旋紧柱头,装柱完成。装柱完成 后,需用高流速平衡柱内的填料。
装柱条件 | Biotin NUPharose FF |
压缩比 | 1.15 |
装柱流速 | 600 cm/h |
4.2 柱效测定和评价
完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常 用理论塔板高度(HETP)和非对称因子(As)来评价。
4.3 推荐缓冲液
推荐用以下缓冲液结合链霉亲和素或者纯化链霉亲和素突变体。
结合缓冲液:20 mM Tris-HCl ,150 mM NaCl ,1 mM EDTA ,pH 8.0
洗脱缓冲液:结合缓冲液 + 10~50 mM D-生物素 再生缓冲液:0.1 M NaOH
4.4 样品纯化
(1)平衡:再用结合缓冲液平衡 5 个柱体积,建议流速为 100~ 150 cm/h。
(2)上样:将准备好的样品上柱,建议流速为 20~ 100cm/h ,可根据实际结合情 况选择流速,能获得较好的效果。上柱的样品应尽量保持与结合缓冲液一致。通常可 用透析、超滤、稀释等方法处理样品。并且上柱前应过 0.45μm 滤膜或高速离心去除 不溶物。
(3)再平衡:上样后用结合缓冲液平衡 5~ 10 个柱体积,或平衡至基线,洗去 杂质,推荐流速为 100~ 150 cm/h。
(4)洗脱:用洗脱缓冲液洗 6~ 10 个柱体积,建议流速为 100~ 150 cm/h,根据需 要置换缓冲液。
(5)NaOH 再生:洗脱目的蛋白后的柱子用纯水清洗 3-5 个柱体积,并用 0.1 M NaOH 再生 3-5 个柱体积,再用纯水清洗至中性,用 20%乙醇保存柱子,或用结合缓 冲液平衡后进行下一次纯化,建议流速为 100~ 150 cm/h。
4.5 填料保存
填料的初始保存液为 20%乙醇,使用过后可继续用 20%乙醇保存。保存温度在 2~8 ℃为宜,不可冻存。