4 、使用方法参考

4.1  色谱柱装填

以下阐述与层析系统连接时，填料的色谱柱装填方法。

（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体最好做脱气处理。

（2）填料用量计算：通过沉降定量填料体积，需要的沉降填料体积=柱体积×压 缩比（也称压缩因子）。沉降体积是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的 稳定体积。Strep-Tactin NUPharose FF 的压缩比为 1.15。为使达到装柱比，可通过柱头 下压的方法，也可以通过高流速压柱。

（3）填料清洗：将填料悬液充分摇匀后量取相应体积，抽滤除去液体，并用约 3 倍填料体积的纯化水洗涤，重复 3 次，以除去保存液。

（4）装柱填料悬液准备：将填料转移到适当的容器中，加入适量的装柱液，制成 50~75 v%的装柱填料悬液，使用前搅匀。

（5）装填前准备：在清洗干净的层析柱下端加入装柱液，以除去下垫片及层析柱 下端的空气，在柱内保留少量的蒸馏水，拧紧下堵头，调整柱子使其垂直于地面。

（6）装填：将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内（必要时使用装柱器）， 为避免引入气泡，应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后，用装柱液将装 柱器加满，拧紧装柱器上盖，将柱子与层析系统连接。

（7）压柱：使柱内填料自然沉降（或 50~ 150 cm/h 的低流速下沉降），待填料沉 降完全后（填料与液体的界面清晰），去除装柱器，装上上柱头，并将柱头下降至界面 处；通过高流速（推荐流速见下表，注意柱压不超过 0.3 MPa），继续压柱至界面清晰 稳定，标记界面稳定时的柱高。停泵，打开柱头上的阀门/堵头，关闭柱底的阀门/堵 头，下压柱头至标记位置下方与压缩比对应的位置，旋紧柱头，装柱完成。装柱完成 后，需用高流速平衡柱内的填料。

4.2  柱效测定和评价

完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常 用理论塔板高度（HETP）和非对称因子（As）来评价。

4.3  推荐缓冲液

推荐用以下缓冲液纯化 Strep II 标签蛋白。

结合缓冲液：100 mM Tris-HCl ，150 mM NaCl ，1 mM EDTA ，pH 8.0；

或 20mM NaH2PO4 ，280 mM NaCl ，6 mM KCl ，pH 7.4 洗脱缓冲液：结合缓冲液 + 2.5 mM  脱硫生物素；

或 0.1 M Glycine-HCl, pH 3.0 或 0.1 M Na2CO3, pH 12.0

或 10 mM NaOH    再生缓冲液：0.1~0.5 M NaOH；

或结合缓冲液+1 mM HABA

4.4  样品纯化

（1）平衡：再用结合缓冲液平衡 5 个柱体积，建议流速为 100~ 150 cm/h。

（2）上样：将准备好的样品上柱，建议流速为 20~ 100cm/h ，可根据实际结合情 况选择流速，能获得较好的效果。上柱的样品应尽量保持与结合缓冲液一致。通常可 用透析、超滤、稀释等方法处理样品。并且上柱前应过 0.45μm 滤膜或高速离心去除 不溶物。

（3）再平衡：上样后用结合缓冲液平衡 5~ 10 个柱体积，或平衡至基线，洗去 杂质，推荐流速为 100~ 150 cm/h。

（4）洗脱：用洗脱缓冲液洗 6~ 10 个柱体积，建议流速为 100~ 150 cm/h ，收集 的洗脱液应立即调节 pH 至稳定范围，并根据需要置换缓冲液。

（5）NaOH 再生：洗脱目的蛋白后的柱子用纯水清洗 3-5 个柱体积，并用 0.1~0.5 M NaOH 再生 3-5 个柱体积，再用纯水清洗至中性，用 20%乙醇保存柱子，或用结合 缓冲液平衡后进行下一次纯化，建议流速为 100~ 150 cm/h。

（6）HABA 再生：用脱硫生物素洗脱目的蛋白时，除了用NaOH 再生，还可 以用HABA 缓冲液再生，一般用含 HABA 的结合缓冲液洗 5~ 15 个柱体积，再用结 合缓冲液洗 10~30 个柱体积，然后可以用20%乙醇保存柱子，或进行下一步纯化。 HABA 上柱后填料颜色先变为黄色，再变为橙红色，说明脱硫生生物被置换，在结 合缓冲液平衡后 HABA 被出去，填料会恢复为白色。

4.5  填料保存

填料的初始保存液为 20%乙醇，使用过后可继续用 20%乙醇保存。保存温度在 2~8 ℃为宜，不可冻存。