1 、产品介绍
Streptavidin NUPharoseFF 是将链霉亲和素(Streptavidin)和纽龙生物 NUPharose 琼 脂糖凝胶偶联而成的生物亲和层析分离介质。该填料基于链霉亲和素与生物素的特异性 结合实现从生物样品或混合物中分离纯化生物素或生物素化的抗原、抗体、核酸等物质, 使用场景主要有以下三类:
l 直接纯化或富集生物素化的生物分子,链霉亲和素与生物素的结合力非常强, 一般需要变性条件下才能将其分离,此时样品或配基易失活。
l 纯化抗原或抗体。将生物素化的抗体结合在填料上,利用抗原抗体的亲和特性 纯化无生物素化的抗原,抗原洗脱时抗体不会被洗脱。反之亦可。
l 纯化 2-亚氨基生物素(2-iminobiotin)标记的生物分子。链霉亲和素与 2-亚氨 基生物素的结合相对生物素较弱,在 pH 9.5~11.0 条件下结合,在 pH=4.0 的非 变性条件下洗脱,不影响样品的活性和凝胶的活性。
2 、产品特点与技术指标
产品名称 | Streptavidin NUPharose FF |
目录编号 | NRPB41L 、NRPB41S(预装柱) |
基质 | 4%交联琼脂糖 |
配基 | 链霉亲和素,~6mg/mL |
粒径范围 a | 45~165 μm |
平均粒径 | ~90 μm |
载量 | ≥6mg/mL(生物素化 BSA)b |
推荐工作流速 | ~150 cm/h(平衡与洗脱),15~100 cm/h(结合) |
最大流速与压力 d | >900 cm/h |
使用 pH | 2~10.5(推荐的工作 pH) |
储存与运输 | 20%乙醇,2~8 ℃保存,2~30 ℃运输 |
保质期 | 3 年 |
注:a90%体积以上的微球在此粒径范围;bDBC10%测试条件为:D-生物素标记 BSA ,10%流穿,
6 min 停留时间;d 10 cm 柱高下的最大测试流速。
3 、链霉亲和素填料应用原理简介
如上所述,Streptavidin NUPharose FF 填料是在 NUPharose 琼脂糖凝胶微球骨架上 修饰链霉亲和素而成(图 1a)。链霉亲和素是同一亚基组成的四聚体蛋白,可特异性结 合 D-生物素以及 D-生物素标记物质(图 1b,c)。链霉亲和素与 D-生物素之间的亲和力 非常高,其解离常数在 10−14 mol/L 数量级,是自然界最强的非共价相互作用之一。因而 Streptavidin NUPharoseFF 填料与生物素标记物质结合后,需要在变性条件下洗脱。在该 使用方式下,样品易失活,填料的性能也受影响。
得益于链霉亲和素配基与 D-生物素之间的高亲和力,结合在 Streptavidin NUPharose FF 填料上的生物素标记抗体可以捕获相应的抗原物质(图2),抗体-抗原复合物可以在 pH=3 左右的酸性条件下解离,从而得到纯化的抗原物质,填料可以重复使用多次。另 外,如果是生物素标记的抗原物质与填料结合,则可以用来富集和纯化相应的抗体。
亚氨基生物素是一种生物素类似物,亚氨基生物素与链霉亲和素之间的结合有着 pH 依赖性。在碱性条件下,亚氨基生物素与链霉亲和素的解离常数在 10−11 mol/L 数量 级,尽管比 D-生物素与链霉亲和素的解离常数高 2~3 个数量级,亚氨基生物素与链霉 亲和素的亲和力仍非常高,在 pH 9~11 条件下,Streptavidin NUPharose FF 可结合亚氨 基生物素标记物质;在 pH 3~4 的酸性条件下,亚氨基生物素被质子化,亚氨基生物素 与链霉亲和素的解离常数在 10−3 mol/L 数量级,即链霉亲和素与亚氨基生物素之间的结 合可在 pH=4 的酸性条件下解离,因而 Streptavidin NUPharose FF 填料在纯化亚氨基生 物素标记物质时,可在温和的条件下洗脱(图 3)。
4 、使用方法参考
4.1 色谱柱装填
以下阐述与层析系统连接时,填料的色谱柱装填方法。
(1)所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样,液体最好做脱气处理。
(2)填料用量计算:通过沉降定量填料体积,需要的沉降填料体积=柱体积×压缩 比(也称压缩因子)。沉降体积是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的稳定 体积。Streptavidin NUPharoseFF 的压缩比为 1.15。为使达到装柱比, 可通过柱头下压的 方法,也可以通过高流速压柱。
(3)填料清洗:将填料悬液充分摇匀后量取相应体积,抽滤除去液体,并用约 3 倍 填料体积的纯化水洗涤,重复 3 次,以除去保存液。
(4)装柱填料悬液准备:将填料转移到适当的容器中,加入适量的装柱液,制成 50~75 v%的装柱填料悬液,使用前搅匀。
(5)装填前准备:在清洗干净的层析柱下端加入装柱液,以除去下垫片及层析柱下 端的空气,在柱内保留少量的蒸馏水,拧紧下堵头,调整柱子使其垂直于地面。
(6)装填:将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内(必要时使用装柱器), 为避免引入气泡,应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后, 用装柱液将装柱 器加满,拧紧装柱器上盖,将柱子与层析系统连接。
(7)压柱:使柱内填料自然沉降(或 50~150 cm/h 的低流速下沉降),待填料沉降 完全后(填料与液体的界面清晰),去除装柱器,装上上柱头,并将柱头下降至界面处; 通过高流速(推荐流速见下表,注意柱压不超过 0.3 MPa),继续压柱至界面清晰稳定, 标记界面稳定时的柱高。停泵, 打开柱头上的阀门/堵头,关闭柱底的阀门/堵头,下压柱 头至标记位置下方与压缩比对应的位置,旋紧柱头,装柱完成。装柱完成后, 需用高流 速平衡柱内的填料。
装柱条件 | Streptavidin NUPharose FF |
压缩比 | 1.15 |
装柱流速 | 300~600 cm/h |
4.2 柱效测定和评价
完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用 理论塔板高度(HETP)和非对称因子(As)来评价。
4.3 使用模式与推荐缓冲液
(1)纯化 D-生物素标记物质
结合缓冲液:20 mM NaH2PO4 ,150 mM NaCl ,pH 7.4
洗脱缓冲液:8 M 盐酸胍,pH 1.5
(2)纯化抗原或抗体
结合缓冲液:20 mM NaH2PO4 ,150 mM NaCl ,pH 7.4 洗脱缓冲液:100 mM 甘氨酸-盐酸,pH 3.0
注:用于生物素化的抗体纯化未生物素化的抗原(或生物素化的抗原纯化未生物 素化的抗体)有 2 种方法,第一种是先在游离状态下抗原与抗体结合,然后当样品纯化 即可;第二种是将生物素化的抗体(或抗原)先结合柱上,然后对应的未生物素化的抗 原(或抗体)当样品纯化。
(3)纯化 2-亚氨基生物素标记物质
结合缓冲液:50 mM 碳酸铵,500 mM NaCl ,pH 10.0
洗脱缓冲液:50 mM 乙酸铵,500 mM NaCl ,pH 4.0
4.4 纯化流程
(1)用结合缓冲液平衡 5 个柱体积,建议流速为 100~150 cm/h。
(2)将准备好的样品缓慢上柱,为保证样品与链霉亲和素充分结合,应控制好上 样流速,建议流速为 15~50 cm/h。
(3)上样后用结合缓冲液平衡 10 个柱体积以上,或平衡至基线,洗去杂质,推 荐流速为 100~150 cm/h。
(4)用洗脱缓冲液洗 10~20 个柱体积,建议流速为 100~150 cm/h,收集的洗脱液 应立即调节 pH 至稳定范围,并根据需要置换缓冲液。
(5)在非变性条件下使用时,洗脱目的蛋白后的柱子应立即用中性的结合缓冲液 平衡,并用 20%乙醇保存柱子,或进行下一次纯化。
4.5 填料保存
填料的初始保存液为 20%乙醇,使用过后可继续用20%乙醇保存。保存温度在 2~8℃ 为宜,不可冻存。