1 、产品介绍
Strep-Tactin 2 NUPharose FF 是链霉亲和素的突变体(Strep-Tactin 2 配基)和纽龙 生物 NUPharose 琼脂糖凝胶偶联形成的和层析分离介质,用于分离、纯化 Strep II 或 Twin Strep 标签蛋白。Strep II 标签为 8 个氨基酸的小标签(WSHPQFEK),一般不影 响融合后蛋白质的结构和功能,常用于融合表达蛋白质的检测和纯化。Twin Strep 标 签为两个 Strep II 串联的标签,相比 Strep II 标签,Twin Strep 标签与 Strep-Tactin 2 配 基的亲和力更高。
本产品的 Strep-Tactin 2 配基与上一代 Strep-Tactin 配基相比,对 Strep II 标签的亲 和力进一步提高,与生物素的亲和力大幅削弱。因而本产品能够更牢固的结合 Strep II 融合蛋白,在融合蛋白表达丰度较低时,相对捕获量更高,载量和得率更高。在洗脱 方面,可以使用生物素进行洗脱,比采用昂贵的脱硫生物素洗脱更经济,且使用后可 采用 10~50 mM NaOH 进行再生。本产品对 Strep II 标签具有高度特异性,一般只需一 步纯化就能获得高纯度的蛋白质样品。
2 、产品特点与技术指标
产品名称 | Strep-Tactin 2 NUPharose FF |
目录编号 | NRPB61L 、NRPB61S(预装柱) |
基质 | 4%交联琼脂糖 |
配基 | Strep-Tactin 2 配基, ≥5 mg/ml |
粒径范围 a | 45~ 165 μm |
平均粒径 | ~90 μm |
动态结合载量 b | 8~ 10 mg/ml Strep II 标签蛋白 |
推荐工作流速 | 60~ 150 cm/h |
最大流速与压力 | >900 cm/h ,0.3 MPa |
使用 pH | 6~ 10(推荐的工作 pH),10~50 mM NaOH(CIP 清洗) |
化学稳定性 | 在以下溶液中稳定:常用的水相缓冲液、8 mol/L 尿素等。 |
储存与运输 | 20%乙醇,2~8 ℃(储存),2~30 ℃(运输) |
保质期 | 3 年 |
注:a90%体积以上的微球在此粒径范围;bDBC10%测试条件为:10%流穿,大肠杆菌表达的带 Strap II 标签的增强型绿色荧光蛋白,6 min 停留时间。
3 、Strep II 、Twin Strep 标签亲和层析
Strep-Tactin 2 NUPharose FF 对 Strep II 、Twin Strep 标签蛋白的特异性结合以及纯 化过程如图 1 和图 2 所示。
4 、使用方法参考
4.1 色谱柱装填
以下阐述与层析系统连接时,填料的色谱柱装填方法。
(1)所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样,液体最好做脱气处理。
(2)填料用量计算:通过沉降定量填料体积,需要的沉降填料体积=柱体积×压缩比(也称压缩因子)。沉降体积是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的 稳定体积。Strep-Tactin 2 NUPharose FF 的压缩比为 1.15 。为使达到装柱比,可通过柱 头下压的方法,也可以通过高流速压柱。
(3)填料清洗:将填料悬液充分摇匀后量取相应体积,抽滤除去液体,并用约 3 倍填料体积的纯化水洗涤,重复 3 次,以除去保存液。
(4)装柱填料悬液准备:将填料转移到适当的容器中,加入适量的装柱液,制成 50~75 v%的装柱填料悬液,使用前搅匀。
(5)装填前准备:在清洗干净的层析柱下端加入装柱液,以除去下垫片及层析柱 下端的空气,在柱内保留少量的蒸馏水,拧紧下堵头,调整柱子使其垂直于地面。
(6)装填:将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内(必要时使用装柱器), 为避免引入气泡,应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后,用装柱液将装 柱器加满,拧紧装柱器上盖,将柱子与层析系统连接。
(7)压柱:使柱内填料自然沉降(或 50~ 150 cm/h 的低流速下沉降),待填料沉 降完全后(填料与液体的界面清晰),去除装柱器,装上上柱头,并将柱头下降至界面 处;通过高流速(推荐流速见下表,注意柱压不超过 0.3 MPa),继续压柱至界面清晰 稳定,标记界面稳定时的柱高。停泵,打开柱头上的阀门/堵头,关闭柱底的阀门/堵 头,下压柱头至标记位置下方与压缩比对应的位置,旋紧柱头,装柱完成。装柱完成 后,需用高流速平衡柱内的填料。
装柱条件 | Strap-Tactin 2 NUPharose FF |
压缩比 | 1.15 |
装柱流速 | 600 cm/h |
4.2 柱效测定和评价
完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常 用理论塔板高度(HETP)和非对称因子(As)来评价。
4.3 平衡与上样(Equilibration & Loading)
Strep-Tactin 2 NUPharose FF 填料的工作 pH 范围为 6~ 10,推荐下述缓冲液 A 为 平衡与上样缓冲液。样品需作澄清处理,并用缓冲液 A 稀释或者换液成缓冲液 A。
缓冲液 A:100mM Tris-HCl ,150mM NaCl ,1mM EDTA ,pH8.0。
平衡 5 个柱体积,建议流速为~ 150 cm/h;上样流速为 50~ 150cm/h ,较小的流速 有利于载量的提高,可根据实际结合情况选择流速,能获得较好的效果。
4.4 再平衡
上样后用缓冲液 A 再平衡 5~ 10 CV ,或平衡至基线,洗去杂质,推荐流速为~ 150 cm/h。
4.5 洗脱(Elution)
推荐含 10~50 mM 的 D-生物素作为洗脱缓冲液,如下述的缓冲液 B。
缓冲液 B:50mM d-Biotin,100 mM Tris-HCl,150 mM NaCl,1 mM EDTA,pH8.0。 用洗脱缓冲液洗 6-10 CV ,建议流速为~ 150 cm/h。
4.6 再生(Regeneration)
在一次或多次使用后,需要对填料进行再生:水,3~5 CV,~ 150 cm/h;10~50 mM NaOH,3 CV,3 min 接触时间;水,3~5 CV,~ 150 cm/h;再用缓冲液 A 平衡 5~ 10 CV,
150 cm/h。
4.7 填料保存
填料的初始保存液为 20%乙醇,使用过后可继续用 20%乙醇保存。保存温度在 2~8 ℃为宜,不可冻存。