1 、产品介绍
NRPB112 & NRPB134——NuPerley IMAC和NuPerley Ni-NTA
NuPerley IMAC 和 NuPerley Ni-NTA 是含次氮基三乙酸(NTA)基团的金属螯合填 料,主要用于带组氨酸标签(His-tag)蛋白的亲和层析,NuPerley 为纽龙生物开发的新 一代高刚性琼脂糖凝胶基础微球。NuPerley IMAC 未螯合金属离子,用户可螯合 Ni2+、 Co2+ 、Cu2+ 、Zn2+等金属离子后使用,NuPerley Ni-NTA 已螯合 Ni2+,用户可直接使用。
通过配基修饰过程的优化,这两款产品做到了亲和力和特异性的平衡:对带组氨酸 标签蛋白的结合量大于 40 mg/mL 的同时,一步纯化后样品纯度可达 90%以上。除了组 氨酸,金属螯合填料也可与色氨酸、半胱氨酸残基形成配位结合, 因而这两款填料也可 用于纯化不带标签但含这些氨基酸残基的蛋白,例如人脱铁转铁蛋白。
与亚氨基二乙酸(IDA)配基相比,NTA 配基的性能更加均衡,具有如下特点。
l 对螯合剂、还原剂、碱等试剂的耐受性更好。例如样品中含有 1 mM EDTA 、 1~10 mM β-巯基乙醇或 5 mM DTT 时,可用Ni-NTANUPharose FF 正常纯化, 纯化后可用 0.1~1 M NaOH 清洗。
l 纯化过程洗脱液中脱落的金属离子可低至 ppb(10-12)级,脱落的金属离子相对 于目标蛋白的摩尔比可低于 0.1。
与平均粒径为 90 μm 的 IMAC NUPharose FF 和 Ni-NTA NUPharose FF 相比,本产 品的平均粒径为~60 μm,有显著提升的分辨率,同时可耐受更高的柱压。同时本产品是 纽龙生物 NTA 系列金属螯合填料中配基密度最高的一款,更适合结合能力弱的带 His- tag 的重组蛋白,展现出对螯合剂和还原剂更强的耐受性。
2 、产品特点与技术指标
产品名称 | NuPerley IMAC | NuPerley Ni-NTA |
目录编号 | NRPB112L 、NRPB112S(预装柱) | NRPB134L 、NRPB134S (预装柱) |
基质 | 高刚性琼脂糖 | |
配基 | 次氮基三乙酸,可螯合~23 μmol Ni2+/ml | 次氮基三乙酸, 预螯合~23 μmol Ni2+/ml |
粒径范围 a | 30~100 μm | |
平均粒径 | ~60 μm | |
动态结合载量 b | ~50 mg/mL 带组氨酸标签蛋白 |
推荐工作流速 | 60~300 cm/h |
最大流速与压力 c | 1500 cm/h,≥0.5 MPa |
pH 稳定性 | 3~12 (推荐的工作 pH),3~12 (长期稳定);2~14(短期稳定) d |
化学稳定性 | 在以下溶液中稳定:常用的水相缓冲液、1 mol/L 氢氧化钠、8 mol/L 尿素、6 mol/L 盐酸胍、70%乙醇等。常见的还原剂、螯合剂、去污剂、变性剂等对填料的影响见 下表。 |
储存与运输 | 20%乙醇,2~30 ℃ |
保质期 | 5 年 |
注:a90%体积以上的微球在此粒径范围;bDBC10%测试条件为:10%流穿,大肠杆菌表达带组氨 酸标签的重组蛋白(纽龙生物,NRPA04),6 min 停留时间;c 10 cm 柱高下的最大测试流速。d 剥离金属离子后 CIP 过程的 pH 稳定性
表中为几款金属螯合填料对各种溶液环境的耐受性测试(静态结合载量测试结果),其中
√表示基本不影响或降低 5%以内
!表示略有影响,降低 15%以内,可使用
!!表示有影响,降低 30%以内,使用需注意
×表示影响大,降低 30~50%,不建议使用
××表示影响很大,降低 50%以上,无法使用
注:a 样品中直接加入试剂,其中 20 mM TCEP 的影响原因是直接加 TCEP 对 pH 有较大影响, EDTA-2Na 的影响原因是剥离 Ni2+ ;b 填料用试剂处理至少 2 h,清洗后填料的性能。
3 、金属螯合亲和层析——NTA
金属离子亲和层析是基于蛋白质分子表面的组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸吲哚基能与 Cu2+ 、Ni2+ 、Zn2+ 、Co2+和 Ca2+形成稳定的配位结合而进行生物大分子 分离纯化的过程。其中,以Ni2+为螯合离子来纯化 6 个组氨酸组成的标签蛋白最为常见, 本说明书也以该体系为例简要阐述 NuPerley Ni-NTA 的亲和原理(图 1)。
NuPerley 基球修饰上 NTA 配基后,该配体拥有四个配位基团,其中一个氮原子和 三个氧原子可以与 Ni2+形成牢固的螯合物。Ni2+可形成 6 配位数的八面体结构,剩余的 两个自由配位点可以与溶剂分子或蛋白质分子结合。Ni2+与组氨酸标签蛋白的两个组氨 酸残基的咪唑基团配位结合的过程即为金属螯合填料与目标蛋白的特异性结合过程。提 高缓冲液中咪唑的浓度可以将目标蛋白洗脱,洗脱过程中咪唑和目标蛋白竞争与 Ni2+ 的 结合。降低 pH 会影响金属离子与配体的结合,因此改变 pH 也是金属螯合层析洗脱过 程的方式之一,但 pH 不宜低于 4 ,pH 过低会将剥离金属离子。
金属离子亲和层析过程的非特异性吸附可能会来自离子相互作用、金属离子与含组氨酸、半胱氨酸、色氨酸蛋白之间的相互作用。前者通过提高缓冲液的离子强度得到抑制,通常添加 500 mM 的 NaCl;后者可在上样缓冲液中添加少量的咪唑(例如~5mM) 或者在冲洗过程中添加咪唑而除去。经过优化,可以得到样品纯度和收率均较高的结果。
NuPerley Ni-NTA 填料在使用过程中 Ni2+掉落量少,可连续使用多次。当填料性能 明显下降后可以用 EDTA 将原金属离子剥离,重新螯合镍后再生使用。
4 、使用方法参考
4.1 色谱柱装填
以下阐述与层析系统连接时,填料的色谱柱装填方法。
(1)所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样,液体最好做脱气处理。
(2)填料用量计算:通过沉降定量填料体积,需要的沉降填料体积=柱体积×压缩 比(也称压缩因子)。沉降体积是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的稳定 体积。NuPerley IMAC 的压缩比为~1.10。为使达到压缩比, 可通过柱头下压的方法,也 可以通过高流速压柱。
(3)填料清洗:将填料悬液充分摇匀后量取相应体积,抽去液体,并用约 3 倍填 料体积的纯化水洗涤,重复 3 次,以除去保存液。
(4)装柱填料悬液准备:将填料转移到适当的容器中,加入适量的装柱液,制成 50~75 v%的装柱填料悬液(原包装中填料体积分数为67%),使用前搅匀。
(5)装填前准备:在清洗干净的层析柱下端加入装柱液,以除去下垫片及层析柱下 端的空气,在柱内保留少量的蒸馏水,拧紧下堵头,调整柱子使其垂直于地面。
(6)装填:将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内(必要时使用装柱器), 为避免引入气泡,应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后, 用装柱液将装柱 器加满,拧紧装柱器上盖,将柱子与层析系统连接。
(7)压柱:使柱内填料自然沉降(或 50~150 cm/h 的低流速下沉降),待填料沉降 完全后(填料与液体的界面清晰),去除装柱器,装上上柱头,并将柱头下降至界面处; 通过高流速(推荐流速见下表,注意柱压不超过 0.3 MPa),继续压柱至界面清晰稳定, 标记界面稳定时的柱高。停泵, 打开柱头上的阀门/堵头,关闭柱底的阀门/堵头,下压柱 头至标记位置下方与压缩比对应的位置,旋紧柱头,装柱完成。装柱完成后, 需用高流 速平衡柱内的填料。
4.2 柱效测定和评价
完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用 理论塔板高度(HETP)和非对称因子(As)来评价。
4.3 螯合金属离子
NuPerley IMAC 以未螯合金属离子的形式出售,用户可以在装柱完成后再层析柱中 螯合金属离子,螯合过程参照以下步骤。
(1)配制 50~200 mM 的金属离子溶液,例如螯合 Ni2+通常用 NiSO4 。螯合 Ni2+ 、 Cu2+、Co2+、Zn2+等不同离子的过程基本相同,需注意控制不同 pH 条件下不同金属离子 的溶解性,pH 过高可导致沉淀。螯合 Zn2+ 时,需控制 pH=5.5 或者更低;螯合 Fe3+ 时, 需控制 pH=3.0 左右。
(2)用纯水清洗色谱柱,纯水用量 3~5 CV(柱体积),流速 100~300 cm/h。
(3)用 0.2~0.8 CV 的金属离子溶液通过色谱柱,流速 50~100 cm/h,金属离子过量 50%时足够螯合完全。例如 NuPerley IMAC 可螯合 25 μmol Ni2+/mL,用 0.8 CV 的 50 mM NiSO4 溶液螯合时,Ni2+过量 60%。螯合完全后色谱柱底部的颜色从白色变为螯合 特定金属离子的颜色。
(4)用纯水清洗色谱柱除去过量的金属离子,纯水用量至少 5 CV,流速 100~300 cm/h。
(5)用 20 mM 醋酸钠+0.5 M NaCl(pH=4.0)缓冲液将螯合不稳定的金属离子除 去,缓冲液用量至少 5 CV,流速 100~300 cm/h。
(6)可直接用结合缓冲液平衡色谱柱。
在装柱前螯合金属离子的过程与上述在色谱柱中螯合一致,可在旋匀仪、反应瓶(釜) 中螯合金属离子,利用过滤器清洗螯合前后的填料。
4.4 平衡与上样(Equilibration & Loading)
金属螯合填料与磷酸盐、Tris-HCl 等缓冲体系兼容,其中 20 mM PB+500 mM NaCl (pH=7.4)的体系最为常用。初始的缓冲液称为平衡缓冲液, 记为缓冲液 A。缓冲液 A 的特点为不含或者含少量咪唑,pH 在 7~8 之间居多,呈弱碱性。实际使用过程中,如 果上样料液的体积特别大,从降低成本的角度考虑,可不往料液中添加咪唑和 NaCl 来 抑制非特异性吸附,而是在上样后进行冲洗来去除杂质。
在上样前,需用缓冲液 A 在操作流速下平衡层析柱,该过程通常需要 5~10 个柱体 积的缓冲液 A,以电导、pH 等检测信号参数不变且与缓冲液 A 对应为准。
上样量可按“mg 目标蛋白/mL 填料”来设定,通常为 DBC10% 的 50~80%,例如本 产品对纽龙生物的重组金黄色葡萄球菌蛋白 A(r-SPA,NRPA04)的 DBC10%为~40 mg/mL, 纯化 r-SPA 时的上样量可为 20~32 mg/mL。除了 DBC10%,也可以测试上样流穿液中的 目标蛋白确定上样量。
上样后需要 3~10 个柱体积的缓冲液 A 再平衡层析柱。
4.5 洗杂(Wash)
在缓冲液 A 中添加 5~40 mM 的咪唑冲洗层析柱,可以将非特异性结合的杂蛋白除 去。咪唑浓度越高, 杂蛋白被除去得越彻底,但会降低目标蛋白的收率。洗杂过程咪唑 的浓度与不同蛋白的特性相关,可通过阶跃洗杂过程(例如 5 mM、10 mM、20 mM……) 快速优化洗杂条件。洗杂的体积通常为 3~10 个柱体积。
4.6 洗脱(Elution)
最常用的洗脱方式为提高洗脱液中咪唑的浓度(在缓冲液 A 中加入咪唑),推荐在 0~500 mM 范围内进行阶跃洗脱或者线性梯度洗脱。对于大多数带组氨酸标签的蛋白, 200 mM 的咪唑浓度可以将目标蛋白洗脱完全。对于一些场合,也可以改变 pH,需注意 pH 不能低于 4。
4.7 再生(Regeneration)
在多次使用后,通常是 5~7 次,需要对填料进行再生。可以选择 0.5~1 柱体积 200 mM EDTA+500 mM NaCl (pH=7)的缓冲液将金属离子剥离。再用 50~200 mM 的金属 盐溶液与 NTA 配基螯合,用纯水将过量的金属离子除去。
金属离子的重新螯合参照 4.3 小节。
4.8 在位清洗(CIP)
通常上述的再生过程可将填料彻底清洗。若发生柱压升高,或为了避免交叉污染, 将金属离子剥离后可进行在位清洗过程。可采用以下溶剂进行在位清洗:2 mol/L NaCl,1 mol/L NaOH 、70%乙醇或 30%异丙醇等。在位清洗可有效去除介质上的杂质,反向效 果更佳。清洗后需用 3~5 柱体积的纯水除去上述溶剂。
4.9 填料保存
填料的初始保存液为 20%乙醇,使用过后可继续用20%乙醇保存。保存温度在 2~30 ℃ 为宜,不可冻存。