1 、产品介绍
NRPB110——NuPerley IDA
NuPerley IDA 是含亚氨基二乙酸(iminodiacetic acid ,IDA)基团的金属螯合填料, 适用于大部分带组氨酸标签(His-tag)蛋白的亲和层析,NuPerley 为纽龙生物开发的新 一代高刚性琼脂糖凝胶基础微球。NuPerley IDA 未螯合金属离子,用户可螯合 Ni2+ 、 Co2+ 、Cu2+ 、Zn2+等金属离子后使用。与平均粒径为 90 μm 的 IDA NUPharose FF 相比, 本产品的平均粒径为~60 μm,有显著提升的分辨率,同时可耐受更高的柱压。
通过独特的配基修饰工艺,NuPerley IDA 产品做到了亲和力和特异性的平衡:对大 部分带组氨酸标签蛋白的结合量大于 40 mg/mL ,一步纯化后样品纯度可达 90%以上。 本产品兼顾高载量、高刚性、高流速、高特异性和较高分辨率, 提供更加丰富的亲和力 与特异性选择。
2 、产品特点与技术指标
产品名称 | NuPerley IDA |
目录编号 | NRPB110L 、NRPB110S(预装柱) |
基质 | 高刚性琼脂糖 |
配基 | 亚氨基二乙酸,可螯合~23 μmol/mL Ni2+,配基密度和螯合金属离子的种类 可定制。 |
粒径范围 a | 30~100 μm |
平均粒径 | ~60 μm |
动态结合载量 b | ≥40 mg/mL 带组氨酸标签蛋白 |
推荐工作流速 | 60~300 cm/h |
最大流速与压力 c | ≥1500 cm/h,≥0.5 MPa |
pH 稳定性 d | 4~8.5(推荐的工作 pH),3~12(长期稳定);2~14(短期稳定) |
化学稳定性 | 在以下溶液中稳定:常用的水相缓冲液、1 mol/L 氢氧化钠、8 mol/L 尿素、 6 mol/L 盐酸胍、70%乙醇。 |
储存与运输 | 20%乙醇,2~30 ℃ |
保质期 | 5 年 |
注:a90%体积以上的微球在此粒径范围;bDBC10%测试条件为:10%流穿,大肠杆菌表达带组氨 酸标签的重组金黄色葡萄球菌蛋白 A(纽龙生物,NRPA04),6 min 停留时间;c 10 cm 柱高下的 最大测试流速;d 未螯合金属离子状态下的 pH 稳定性。
3 、金属螯合亲和层析——IDA
金属螯合亲和层析是基于蛋白质分子表面的组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色 氨酸吲哚基能与 Cu2+ 、Ni2+ 、Zn2+ 、Co2+等金属离子形成稳定的配位结合而进行生物大 分子分离纯化的过程。其中, 以 Ni2+为螯合离子来纯化 6 个或更多组氨酸组成的Hig-tag 标签蛋白最为常见,本说明书也以该体系为例简要阐述 NuPerley IDA 的亲和原理(图 1)。
NuPerley 基球修饰上 IDA 配基后,该配体拥有三个配位基团,其中一个氮原子和两 个氧原子可以与 Ni2+形成牢固的螯合物。Ni2+可形成 6 配位数的八面体结构,剩余的三 个自由配位点可以与溶剂分子或蛋白质分子结合。Ni2+与组氨酸标签蛋白的组氨酸残基 的咪唑基团配位结合的过程即为金属螯合填料与目标蛋白的特异性结合过程。提高缓冲 液中咪唑的浓度可以将目标蛋白洗脱,洗脱过程中咪唑和目标蛋白竞争与 Ni2+ 的结合。 降低 pH 会影响金属离子与配体的结合,因此改变 pH 也是金属螯合层析洗脱过程的方 式之一,但 pH 不宜低于 4 ,pH 过低会将剥离金属离子。通常也用 pH 4 的醋酸钠缓冲 液清洗螯合 Ni2+后的填料,以除去未稳定螯合的 Ni2+。纽龙生物拥有独特的 IDA 配基偶 联工艺,该工艺使得 IDA 配基与 Ni2+形成的三配位螯合物完整度高,从而实现亲和力与 特异性的平衡,纯化过程中金属离子脱落少。
金属离子亲和层析过程的非特异性吸附可能来自离子相互作用、金属离子与含组氨 酸、半胱氨酸、色氨酸的杂蛋白之间的相互作用。前者通过提高缓冲液的离子强度得到 抑制,通常添加 500 mM 的 NaCl;后者可在上样缓冲液中添加少量的咪唑(例如~5 mM) 或者在冲洗过程中添加咪唑而除去。经过优化,可以得到样品纯度和收率均较高的结果。 NuPerley IDA 填料在使用过程中 Ni2+脱落量少,可连续使用多次。当填料性能明显下降 后可以用 EDTA 将原金属离子剥离,重新螯合镍后再生使用。不同金属离子对目标蛋白的亲和力与特异性不同,Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+ 的亲和力依次降低(影响产率),特异性依次升高(影响纯度),可根据分离需求选定合适的金属 离子。对于大多数带 Hig-tag 标签的重组蛋白,Ni2+通常是首先考虑的金属离子,建议使 用螯合 Ni2+ 的 NuPerley IDA。对于含组氨酸、半胱氨酸或色氨酸的非标签蛋白, Cu2+ 的 高亲和力有利于结合目标蛋白。对于磷蛋白,可考虑使用四价或者三价离子。值得注意 的是,上述规律不总是成立,需根据目标蛋白筛选合适的金属离子。
4 、使用方法参考
4.1 色谱柱装填
以下阐述与层析系统连接时,填料的色谱柱装填方法。
(1)所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样,液体最好做脱气处理。
(2)填料用量计算:通过沉降定量填料体积,需要的沉降填料体积=柱体积×压缩 比(也称压缩因子)。沉降体积是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的稳定 体积。NuPerley IDA 的压缩比为 1.10~1.15。为使达到装柱比, 可通过柱头下压的方法, 也可以通过高流速压柱。
(3)填料清洗:将填料悬液充分摇匀后量取相应体积,抽滤除去液体,并用约 3 倍 填料体积的纯化水洗涤,重复 3 次,以除去保存液。
(4)装柱填料悬液准备:将填料转移到适当的容器中,加入适量的装柱液,制成 50~75 v%的装柱填料悬液,使用前搅匀。
(5)装填前准备:在清洗干净的层析柱下端加入装柱液,以除去下垫片及层析柱下 端的空气,在柱内保留少量的蒸馏水,拧紧下堵头,调整柱子使其垂直于地面。
(6)装填:将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内(必要时使用装柱器), 为避免引入气泡,应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后, 用装柱液将装柱 器加满,拧紧装柱器上盖,将柱子与层析系统连接。
(7)压柱:使柱内填料自然沉降(或 50~150 cm/h 的低流速下沉降),待填料沉降 完全后(填料与液体的界面清晰),去除装柱器,装上上柱头,并将柱头下降至界面处; 通过高流速(推荐流速见下表,注意柱压不超过 0.3 MPa),继续压柱至界面清晰稳定, 标记界面稳定时的柱高。停泵, 打开柱头上的阀门/堵头,关闭柱底的阀门/堵头,下压柱 头至标记位置下方与压缩比对应的位置,旋紧柱头,装柱完成。装柱完成后, 需用高流 速平衡柱内的填料。
4.2 柱效测定和评价
完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用 理论塔板高度(HETP)和非对称因子(As)来评价。
4.3 螯合金属离子
NuPerley IDA 以未螯合金属离子的形式出售,用户可以在装柱完成后再层析柱中螯 合金属离子,螯合过程参照以下步骤。
(1)配制 50~200 mM 的金属离子溶液,例如螯合 Ni2+通常用 NiSO4 。螯合 Ni2+ 、 Cu2+、Co2+、Zn2+等不同离子的过程基本相同,需注意控制不同 pH 条件下不同金属离子 的溶解性,pH 过高可导致沉淀。螯合 Zn2+ 时,需控制 pH=5.5 或者更低;螯合 Fe3+ 时, 需控制 pH=3.0 左右。
(2)用纯水清洗色谱柱,纯水用量 3~5 CV(柱体积),流速 100~300 cm/h。
(3)用 0.2~0.8 CV 的金属离子溶液通过色谱柱,流速 50~100 cm/h,金属离子过量 50%时足够螯合完全。例如 NuPerley IDA 可螯合 23 μmol Ni2+/mL,用 0.7 CV 的 50 mM NiSO4 溶液螯合时,Ni2+过量 52%。螯合完全后色谱柱底部的颜色从白色变为螯合特定 金属离子的颜色。
(4)用纯水清洗色谱柱除去过量的金属离子,纯水用量至少 5 CV,流速 100~300 cm/h。
(5)用 20 mM 醋酸钠+0.5 M NaCl(pH=4.0)缓冲液将螯合不稳定的金属离子除 去,缓冲液用量至少 5 CV,流速 100~300 cm/h。
(6)可直接用结合缓冲液平衡色谱柱。
在装柱前螯合金属离子的过程与上述在色谱柱中螯合一致,可在旋匀仪、反应瓶(釜) 中螯合金属离子,利用过滤器清洗螯合前后的填料。
4.4 平衡与上样(Equilibration & Loading)
金属螯合填料与磷酸盐、Tris-HCl 等缓冲体系兼容,其中“20 mM PB+500 mM NaCl (pH=7.4)”的缓冲体系最为常用。初始的缓冲液称为平衡缓冲液, 记为缓冲液 A。缓冲 液 A 的特点为不含或者含少量咪唑,pH 在 7~8 之间居多,呈弱碱性。实际使用过程中, 如果上样料液的体积特别大,从降低成本的角度考虑,可不往料液中添加咪唑和 NaCl 来抑制非特异性吸附,而是在上样后进行冲洗来去除杂质。
在上样前,需用缓冲液 A 在操作流速下平衡层析柱,该过程通常需要 5~10 个柱体 积的缓冲液 A,以电导、pH 等检测信号参数不变且与缓冲液 A 对应为准。
上样量可按“mg 目标蛋白/mL 填料”来设定,通常为 DBC10% 的 50~80%,例如 NuPerley IDA 产品对纽龙生物的重组金黄色葡萄球菌蛋白 A(r-SPA,NRPA04)的 DBC10% 为~40 mg/mL,纯化 r-SPA 时的上样量可为 20~32 mg/mL。除了 DBC10%,也可以测试上 样流穿液中的目标蛋白确定上样量。上样前需要对样品进行离心(10000 g 以上)或/和 过滤(0.22 或 0.45 μm)等澄清处理,以免堵塞色谱柱。样品的 pH 和盐浓度可用缓冲液 A 或浓度更高的母液调节。
上样后需要 3~10 个柱体积的缓冲液 A 再平衡层析柱。
4.5 洗杂(Wash)
在缓冲液 A 中添加 5~40 mM 的咪唑冲洗层析柱,可以将非特异性结合的杂蛋白除 去。咪唑浓度越高, 杂蛋白被除去得越彻底,但会降低目标蛋白的收率。洗杂过程咪唑 的浓度与不同蛋白的特性相关,可通过阶跃洗杂过程(例如 5 mM、10 mM、20 mM……) 快速优化洗杂条件。洗杂的体积通常为 3~10 个柱体积。
4.6 洗脱(Elution)
最常用的洗脱方式为提高洗脱液中咪唑的浓度(在缓冲液 A 中加入咪唑),推荐在 0~500 mM 范围内进行阶跃洗脱或者线性梯度洗脱。对于大多数带组氨酸标签的蛋白, 200 mM 的咪唑浓度可以将目标蛋白洗脱完全。对于一些场合,也可以改变 pH,结合较 弱的蛋白可在 pH 6 时可洗脱,结合较强的蛋白可在 pH 6~4 时洗脱,需注意 pH 不能低 于 4
4.7 再生(Regeneration)
在多次使用后,需要对填料进行再生。可以选择 0.5~1 柱体积 200 mM EDTA+500 mM NaCl (pH=7)的缓冲液将金属离子剥离。再用 50~200 mM 的金属盐溶液与 IDA 配 基螯合,用纯水将过量的金属离子除去,用 20 mM 醋酸钠+0.5 M NaCl(pH=4.0)缓冲 液将螯合不稳定的金属离子除去。
金属离子的重新螯合参照 4.3 小节。
4.8 在位清洗(CIP)
通常上述的再生过程可将填料彻底清洗。若发生柱压升高,或为了避免交叉污染, 将金属离子剥离后可进行在位清洗过程。可采用以下溶剂进行在位清洗:2 mol/L NaCl , 1 mol/L NaOH 、70%乙醇或 30%异丙醇等。在位清洗可有效去除介质上的杂质,反向效 果更佳。清洗后需用 3~5 柱体积的纯水除去上述溶剂。
4.9 填料保存
填料的初始保存液为 20%乙醇,使用过后可继续用20%乙醇保存。保存温度在 2~30 ℃ 为宜,不可冻存。