1 、产品介绍
NRPB58——Ni-TED NUPharose FF
Ni-TED NUPharose FF 是金属离子脱落率最低的一款金属螯合亲和填料,配基为三 羧甲基乙二胺(tris-carboxymethyl ethylene diamine,TED)基团,配位金属离子为 Ni2+ , NUPharose 为纽龙生物开发的经典琼脂糖凝胶基础微球,FF 为 Fast Flow 的缩写。
本产品的 TED 配基与 Ni2+形成的五配位结构稳定性好,对螯合剂、还原剂、酸、碱 等试剂有着出色的耐受性,可在 10 mM EDTA 、100 mM β-ME 或 50 mM DTT 等条件下 正常使用,可在 pH=1 或 pH=14 的条件下处理 24 h 后保持出色的色谱性能,也长期保 存在 10 mM NaOH 中,洗脱液中需要的咪唑浓度相对其他金属螯合填料更低。因此, Ni-TED NUPharose FF 适合用于下列纯化体系:
l 目标蛋白中含半胱氨酸或者对氧敏感,需要添加 β-ME 或 DTT 时;
l 目标蛋白中含半胱氨酸且有金属反应性,需要添加 DTT 和 EDTA 时;
l 目标蛋白容易被金属蛋白酶水解,需要添加 EDTA 时;
l 目标蛋白对高浓度咪唑敏感,需要降低洗脱液中咪唑浓度时;
l 真核细胞表达体系中本身含 β-ME 或 EDTA 的情况;
l 对产物中金属离子含量要求严格时。
Ni-TED NUPharoseFF 的配基偶联工艺经过了特殊的设计,使得成品的压力/流速特 性得到大幅提升,最大流速和耐压分别超过 1500 cm/h 和 0.5 MPa。通过配基修饰过程 的优化,本产品在亲和力(载量)和特异性(选择性)之间取得良好的均衡:对带组氨 酸标签蛋白的结合量大于 20 mg/mL 的同时,一步纯化后样品纯度可达 90%以上。
2 、产品特点与技术指标
产品名称 | Ni-TED NUPharose FF |
目录编号 | NRPB58L 、NRPB58S(预装柱) |
基质 | 6%交联琼脂糖 |
配基 a | 三羧甲基乙二胺,螯合~60 μmol Ni2+/mL |
粒径范围 b | 45~165 μm |
平均粒径 | ~90 μm |
动态结合载量 c | ≥20 mg/mL 带组氨酸标签蛋白 |
推荐工作流速 d | 60~300 cm/h |
最大流速与压力 e | >1500 cm/h ,0.5 MPa |
使用 pH | 3~12(推荐的工作 pH),3~12(长期稳定);2~14(短期稳定) |
化学稳定性 | 1)纯化缓冲液:常用的水相缓冲液,可含有 10 mM EDTA ,100 mM β-ME 或 50 mM DTT。 2)在位清洗(CIP)处理:1 M NaOH 、1~2 M NaCl 、70%乙醇、 30%异丙醇,0.1~0.5%非离子型表面活性剂。 3)在下述溶液中处理特定时间,填料性能保持稳定:10 mM NaOH (长期)、0.1 M 盐酸(24 h)、6 M 盐酸胍(24 h)。 |
储存与运输 | 20%乙醇,2~30 ℃ |
保质期 | 5 年 |
a 三羧甲基乙二胺(TED)基团与基球之间有十个原子长度的间隔臂,为亲和填料提 供更加高效的捕获效果。
b90%体积以上的微球在此粒径范围。
c 10%穿透下的动态结合载量(DBC10%),测试的样品为大肠杆菌表达带组氨酸标签 的重组蛋白(纽龙生物,NRPA04),6 min 停留时间。
d 并非指只能在该流速范围内工作。需结合柱高确定适宜的工作流速,通常情况下 上样的停留时间 2~6 min 范围内可保持出色的亲和捕获能力和纯化效率。CIP 过程的流 速则一般不超过 150 cm/h。
e 10 cm 柱高下的最大测试流速及该最大流速下的压力。
3、金属螯合亲和层析
金属离子亲和层析是基于蛋白质分子表面的组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色 氨酸吲哚基能与 Ni2+ 、Co2+ 、Cu2+ 、Zn2+等形成配位结合而进行生物大分子分离纯化的 过程。其中, 以 Ni2+为螯合离子来纯化带 6 个以上组氨酸组成的标签蛋白最为常见,本 说明书也以该体系为例简要阐述 Ni-TED NUPharose FF 的亲和原理(图 1)。
NUPharose 基球修饰上 TED 配基后,该配体拥有五个配位基团,其中两个氮原子和 三个氧原子与 Ni2+形成牢固的螯合物。Ni2+可形成 6 配位数的八面体结构,剩余的一个 自由配位点可以与溶剂分子或蛋白质分子结合。Ni2+与组氨酸标签蛋白的咪唑基团配位 结合的过程即为金属螯合填料与目标蛋白的特异性结合过程。提高缓冲液中咪唑的浓度 可以将目标蛋白洗脱,洗脱过程中咪唑和目标蛋白竞争与 Ni2+ 的结合。
金属离子亲和层析过程的非特异性吸附可能会来自离子相互作用、金属离子与含组 氨酸、半胱氨酸、色氨酸蛋白之间的相互作用。前者可通过提高缓冲液的离子强度得到 抑制,通常添加 500 mM 的 NaCl;后者可在上样缓冲液中添加少量的咪唑(例如~5 mM) 或者在冲洗过程中添加咪唑而除去。经过优化,可以得到样品纯度和收率均较高的结果。
Ni-TED NUPharose FF 填料在使用过程中 Ni2+掉落量极少,可连续使用多次。
4 、使用方法参考
4.1 色谱柱装填
以下阐述与层析系统连接时,填料的色谱柱装填方法。
(1)所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样,液体最好做脱气处理。
(2)填料用量计算:通过沉降定量填料体积,需要的沉降填料体积=柱体积×压缩 比(也称压缩因子)。沉降体积是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的稳定 体积。Ni-TED NUPharose FF 的压缩比为 1.15。为使达到压缩比,可通过柱头下压的方 法,也可以通过高流速压柱。
(3)填料清洗:将填料悬液充分摇匀后量取相应体积,抽去液体,并用约 3 倍填 料体积的纯化水洗涤,重复 3 次,以除去保存液。
(4)装柱填料悬液准备:将填料转移到适当的容器中,加入适量的装柱液,制成 50~75 v%的装柱填料悬液(原包装中填料体积分数为67%),使用前搅匀。
(5)装填前准备:在清洗干净的层析柱下端加入装柱液,以除去下垫片及层析柱下 端的空气,在柱内保留少量的蒸馏水,拧紧下堵头,调整柱子使其垂直于地面。
(6)装填:将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内(必要时使用装柱器), 为避免引入气泡,应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后, 用装柱液将装柱 器加满,拧紧装柱器上盖,将柱子与层析系统连接。
(7)压柱:使柱内填料自然沉降(或 50~150 cm/h 的低流速下沉降),待填料沉降 完全后(填料与液体的界面清晰),去除装柱器,装上上柱头,并将柱头下降至界面处; 通过高流速(推荐流速见下表,注意柱压不超过 0.3 MPa),继续压柱至界面清晰稳定, 标记界面稳定时的柱高。停泵, 打开柱头上的阀门/堵头,关闭柱底的阀门/堵头,下压柱 头至标记位置下方与压缩比对应的位置,旋紧柱头,装柱完成。装柱完成后, 需用高流 速平衡柱内的填料。
4.2 柱效测定和评价
完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用 理论塔板高度(HETP)和非对称因子(As)来评价。
4.3 平衡与上样(Equilibration & Loading)
金属螯合填料与磷酸盐、Tris-HCl 等缓冲体系兼容,其中 20 mM PB+500 mM NaCl (pH=7.4)的体系最为常用。初始的缓冲液称为平衡缓冲液, 记为缓冲液 A。缓冲液 A 的特点为不含或者含少量咪唑,pH 在 7~8 之间居多,呈弱碱性。实际使用过程中,如 果上样料液的体积特别大,从降低成本的角度考虑,可不往料液中添加咪唑和 NaCl 来 抑制非特异性吸附,而是在上样后进行冲洗来去除杂质。
在上样前,需用缓冲液 A 在操作流速下平衡层析柱,该过程通常需要 5~10 个柱体 积的缓冲液 A,以电导、pH 等检测信号参数不变且与缓冲液 A 对应为准。
上样量可按“mg 目标蛋白/mL 填料”来设定,通常为 DBC10% 的 50~80%,例如 Ni- TED NUPharoseFF 产品对纽龙生物的重组金黄色葡萄球菌蛋白 A(r-SPA,NRPA04)的 DBC10%为~20 mg/mL,纯化 r-SPA 时的上样量可为 10~16 mg/mL。除了 DBC10%,也可 以测试上样流穿液中的目标蛋白确定上样量。
上样后需要 3~10 个柱体积的缓冲液 A 再平衡层析柱。
4.4 洗杂(Wash)
在缓冲液 A 中添加 5~40 mM 的咪唑冲洗层析柱,可以将非特异性结合的杂蛋白除 去。咪唑浓度越高, 杂蛋白被除去得越彻底,但会降低目标蛋白的收率。洗杂过程咪唑 的浓度与不同蛋白的特性相关,可通过阶跃洗杂过程(例如 5 mM、10 mM、20 mM……) 快速优化洗杂条件。洗杂的体积通常为 3~10 个柱体积。
4.5 洗脱(Elution)
最常用的洗脱方式为提高洗脱液中咪唑的浓度(在缓冲液 A 中加入咪唑),推荐在 0~500 mM 范围内进行阶跃洗脱或者线性梯度洗脱,确定最优的洗脱浓度。对于大多数 带组氨酸标签的蛋白,50~150 mM 的咪唑浓度可以将目标蛋白洗脱完全。
4.6 在位清洗(CIP)
通常上述的再生过程可将填料彻底清洗。若发生柱压升高,或为了避免交叉污染, 将金属离子剥离后可进行在位清洗过程。可采用以下溶剂进行在位清洗:2 mol/L NaCl , 1 mol/L NaOH 、70%乙醇或 30%异丙醇等。在位清洗可有效去除介质上的杂质,反向效 果更佳。清洗后需用 3~5 柱体积的纯水除去上述溶剂。
4.7 填料保存
填料的初始保存液为 20%乙醇,使用过后可继续用20%乙醇保存。保存温度在 2~30 ℃ 为宜,不可冻存。