4 、使用方法参考

4.1  色谱柱装填

以下阐述与层析系统连接时，填料的色谱柱装填方法。

（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体最好做脱气处理。

（2）填料用量计算：通过沉降定量填料体积，需要的沉降填料体积=柱体积×压缩 比（也称压缩因子）。沉降体积是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的稳定 体积。Co-NTANUPharoseFF 的压缩比为 1.15。为使达到压缩比，可通过柱头下压的方 法，也可以通过高流速压柱。

（3）填料清洗：将填料悬液充分摇匀后量取相应体积，抽去液体，并用约 3 倍填 料体积的纯化水洗涤，重复 3 次，以除去保存液。

（4）装柱填料悬液准备：将填料转移到适当的容器中，加入适量的装柱液，制成 50~75 v%的装柱填料悬液（原包装中填料体积分数为67%），使用前搅匀。

（5）装填前准备：在清洗干净的层析柱下端加入装柱液，以除去下垫片及层析柱下 端的空气，在柱内保留少量的蒸馏水，拧紧下堵头，调整柱子使其垂直于地面。

（6）装填：将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内（必要时使用装柱器）， 为避免引入气泡，应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后， 用装柱液将装柱 器加满，拧紧装柱器上盖，将柱子与层析系统连接。

（7）压柱：使柱内填料自然沉降（或 50~150 cm/h 的低流速下沉降），待填料沉降 完全后（填料与液体的界面清晰），去除装柱器，装上上柱头，并将柱头下降至界面处； 通过高流速（推荐流速见下表，注意柱压不超过 0.3 MPa），继续压柱至界面清晰稳定， 标记界面稳定时的柱高。停泵， 打开柱头上的阀门/堵头，关闭柱底的阀门/堵头，下压柱 头至标记位置下方与压缩比对应的位置，旋紧柱头，装柱完成。装柱完成后， 需用高流 速平衡柱内的填料。

4.2  柱效测定和评价

完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用 理论塔板高度（HETP）和非对称因子（As）来评价。

4.3  螯合金属离子

Co-NTANUPharoseFF 以预螯合金属离子的形式出售，在必要时可将金属离子剥离 （参照 4.7 小节），重新螯合 Co2+过程参照以下步骤。

（1）配制 50 mM 的 CoCl2 溶液。

（2）用纯水清洗色谱柱，纯水用量 3~5 CV（柱体积），流速 100~300 cm/h。

（3）用 3~5 CV 的金属离子溶液通过色谱柱，流速 50~100 cm/h ，螯合完全后色谱 柱底部的颜色从白色变为 Co2+ 的粉红色。

（4）用纯水清洗色谱柱除去过量的金属离子，纯水用量至少 5 CV，流速 100~300 cm/h。

（5）用 0.3 M 的 NaCl 溶液将螯合不稳定的金属离子除去，缓冲液用量至少 3 CV， 流速 100~300 cm/h。

（6）可直接用结合缓冲液平衡色谱柱。

在装柱前螯合金属离子的过程与上述在色谱柱中螯合一致，可在旋匀仪、反应瓶（釜） 中螯合金属离子，1 CV 的 CoCl2 溶液即可，利用过滤器清洗螯合前后的填料。

4.4  平衡与上样（Equilibration & Loading）

金属螯合填料与磷酸盐、Tris-HCl 等缓冲体系兼容，其中 20 mM PB+150~500 mM NaCl（pH=7.4）的体系最为常用。初始的缓冲液称为平衡缓冲液，记为缓冲液 A。缓冲 液 A 通常不含咪唑（对于 Ni-NTA NUPharose FF，可在样品中添加 5~40 mM 咪唑，这是两种填料的区别），pH 在 7~8 之间居多，呈弱碱性。

在上样前，需用缓冲液 A 在操作流速下平衡层析柱，该过程通常需要 5~10 个柱体 积的缓冲液 A，以电导、pH 等检测信号参数不变且与缓冲液 A 对应为准。

上样量可按“mg 目标蛋白/mL 填料”来设定，通常为 DBC10% 的 50~80%，例如 Co- NTANUPharoseFF 产品对纽龙生物的重组金黄色葡萄球菌蛋白 A（r-SPA，NRPA04）的 DBC10%为~40 mg/mL，纯化 r-SPA 时的上样量可为 20~32 mg/mL。除了 DBC10%，也可 以测试上样流穿液中的目标蛋白确定上样量。

上样后需要 3~10 个柱体积的缓冲液 A 再平衡层析柱。

4.5  洗杂（Wash）

在缓冲液 A 中添加 5 mM 的咪唑冲洗层析柱，可以将非特异性结合的杂蛋白除去。 咪唑浓度越高，杂蛋白被除去得越彻底，但会降低目标蛋白的收率。洗杂过程咪唑的浓 度与不同蛋白的特性相关，对于 Co-NTANUPharose FF，通常 5 mM 的浓度可以将杂蛋 白除去。洗杂的体积通常为 3~10 个柱体积。

4.6  洗脱（Elution）

最常用的洗脱方式为提高洗脱液中咪唑的浓度（在缓冲液 A 中加入咪唑），推荐在 0~200 mM 范围内进行阶跃洗脱或者线性梯度洗脱。对于大多数带组氨酸标签的蛋白， 200 mM 的咪唑浓度可以将目标蛋白洗脱完全。对于一些场合，也可以改变 pH，需注意 pH 不能低于 4。

4.7  再生（Regeneration）

在多次使用后，通常是 2~7 次，需要对填料进行再生，纯化同一种蛋白可更多次， 试具体情况而定。可以选择 0.5~1 柱体积 200 mM EDTA+500 mM NaCl  （pH=7）的缓 冲液将金属离子剥离。金属离子的重新螯合参照 4.3 小节。

4.8  在位清洗（CIP）

通常上述的再生过程可将填料彻底清洗。若发生柱压升高，或为了避免交叉污染， 将金属离子剥离后可进行在位清洗过程。可采用以下溶剂进行在位清洗：2 mol/L NaCl ， 1 mol/L NaOH 、70%乙醇或 30%异丙醇等。在位清洗可有效去除介质上的杂质，反向效 果更佳。清洗后需用 3~5  柱体积的纯水除去上述溶剂。

4.9  填料保存

填料的初始保存液为 20%乙醇，使用过后可继续用20%乙醇保存。保存温度在 2~30 ℃ 为宜，不可冻存。