4 、使用方法参考

4.1  色谱柱装填

以下阐述与层析系统连接时，填料的色谱柱装填方法。

（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体最好做脱气处理。

（2）填料用量计算：通过沉降定量填料体积，需要的沉降填料体积=柱体积×压缩 比（也称压缩因子）。沉降体积是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的稳定 体积。Butyl-S NUPharoseFF 的压缩比为 1.15，NuPerley Butyl-S 的压缩比为~1.10。为使 达到装柱比，可通过柱头下压的方法，也可以通过高流速压柱。

（3）填料清洗：疏水填料无需清洗，可直接用保存液装柱，用 10~20%的乙醇作为装柱液。

（4）装柱填料悬液准备：将填料转移到适当的容器中，加入适量的装柱液，制成 50~75 v%的装柱填料悬液（原包装中填料体积分数为67%），使用前搅匀。

（5）装填前准备：在清洗干净的层析柱下端加入装柱液，以除去下垫片及层析柱下 端的空气，在柱内保留少量的蒸馏水，拧紧下堵头，调整柱子使其垂直于地面。

（6）装填：将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内（必要时使用装柱器）， 为避免引入气泡，应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后， 用装柱液将装柱 器加满，拧紧装柱器上盖，将柱子与层析系统连接。

（7）压柱：使柱内填料自然沉降（或 50~150 cm/h 的低流速下沉降），待填料沉降 完全后（填料与液体的界面清晰），去除装柱器，装上上柱头，并将柱头下降至界面处； 通过高流速（推荐流速见下表，注意柱压不超过 0.3 MPa），继续压柱至界面清晰稳定， 标记界面稳定时的柱高。停泵， 打开柱头上的阀门/堵头，关闭柱底的阀门/堵头，下压柱 头至标记位置下方与压缩比对应的位置，旋紧柱头，装柱完成。装柱完成后，需用高流 速平衡柱内的填料。

4.2  柱效测定和评价

完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用 理论塔板高度（HETP）和非对称因子（As）来评价。

4.3  平衡与上样（Equilibration & Loading）

在上样前，需用平衡缓冲液在操作流速下平衡层析柱，观察检测器的变化，直到电 导、pH 等参数不变。磷酸盐-硫酸铵溶液是最常用的疏水层析盐溶液体系，也可以根据 盐析原理选择其他盐。

疏水层析过程一般采取“高盐上样、低盐洗脱”的模式，样品的预处理通常有置换 缓冲液、加盐、过滤（0.45 、0.22μm）等过程。

上样量可按“mg  目标蛋白/mL  填料”来设定，通常为 DBC10% 的 50~80%。除了 DBC10%，也可以测试上样流穿液中的目标蛋白确定上样量。

4.4  洗脱（Elution）

用 2-3 个柱体积的平衡缓冲液冲洗上样后的层析柱，观察检测器的变化，直到电导、 pH 等参数不变，此时结合的组分被清洗出去。

疏水层析柱的洗脱可用恒定洗脱、梯度洗脱或者阶跃洗脱，一般推荐降低盐浓度的 梯度洗脱进行。亦可根据实际情况，添加有机溶剂进行洗脱。

4.5  再生（Regeneration）

用蒸馏水按操作流速冲洗 3-5 个柱体积，接着用平衡液洗到平衡 3-5 个柱体积。 若有失活蛋白质或脂类物质在再生时洗不掉，可用在位清洗（CIP）除去。

4.6  在位清洗（CIP）

可采用以下选择进行在位清洗：0.5~1 mol/L NaOH、8 mol/L 尿素和 30%异丙醇等。 在位清洗可有效去除介质上的杂质，反向效果更佳。