4 、使用方法参考

4.1  色谱柱装填

以下阐述与层析系统连接时，填料的色谱柱装填方法。

（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体最好做脱气处理。

（2）填料用量计算：通过沉降定量填料体积，需要的沉降填料体积=柱体积×压缩 比（也称压缩因子）。沉降体积是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的稳定 体积。Blue NUPharoseFF 的压缩比为 1.15。为使达到装柱比，可通过柱头下压的方法， 也可以通过高流速压柱。

（3）填料清洗：将填料悬液充分摇匀后量取相应体积，抽滤除去液体，并用约 3 倍 填料体积的纯化水洗涤，重复 3 次，以除去保存液。

（4）装柱填料悬液准备：将填料转移到适当的容器中，加入适量的装柱液，制成 50~75 v%的装柱填料悬液，使用前搅匀。

（5）装填前准备：在清洗干净的层析柱下端加入装柱液，以除去下垫片及层析柱下 端的空气，在柱内保留少量的装柱液，拧紧下堵头，调整柱子使其垂直于地面。

（6）装填：将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内（必要时使用装柱器）， 为避免引入气泡，应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后， 用装柱液将装柱 器加满，拧紧装柱器上盖，将柱子与层析系统连接。

（7）压柱：使柱内填料自然沉降（或 50~150 cm/h 的低流速下沉降），待填料沉降完全后（填料与液体的界面清晰），去除装柱器，装上上柱头，并将柱头下降至界面处； 通过高流速（推荐流速见下表，注意柱压不超过 0.3 MPa），继续压柱至界面清晰稳定， 标记界面稳定时的柱高。停泵， 打开柱头上的阀门/堵头，关闭柱底的阀门/堵头，下压柱 头至标记位置下方与压缩比对应的位置，旋紧柱头，装柱完成。装柱完成后， 需用高流 速平衡柱内的填料。

4.2  柱效测定和评价

完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用 理论塔板高度（HETP）和非对称因子（As）来评价.

4.3  平衡与上样（Equilibration & Loading）

结合缓冲液

常见的磷酸盐、醋酸盐等均可作为结合缓冲液，需根据样品特点选择合适的结合缓 冲液（记为缓冲液 A）。根据第 3 章节的染料亲和层析原理，适当低的 pH 的结合缓冲液 能促进蛋白的结合，一般情况下 pH  范围在 5.5~8.0 之间宜。

实际使用过程中，上样料液的体积往往较大，在上样前，需用缓冲液 A 在操作流速 下平衡层析柱，该过程通常需要 5~10 个柱体积的缓冲液 A，以电导、pH 等检测信号参 数不变且与缓冲液 A 对应为准。

上样量可按“mg  目标蛋白/mL 填料”来设定，通常为 DBC10% 的 50~80%，例如 Blue  NUPharose FF 产品对 BSA 的 DBC10%为~20 mg/mL，纯化时上样量可为 10~16 mg/mL。 除了 DBC10%，也可以测试上样流穿液中的目标蛋白确定上样量。上样前需要对样品进 行离心（10000 g 以上）、过滤（0.22 或 0.45 μm）处理，以免堵塞色谱柱，样品的 pH 需 与上样缓冲液保持一致。

上样后需要 3~10 个柱体积的缓冲液 A 再平衡层析柱。

4.4  洗脱（Regeneration）

染料亲和的样品多种多样，亲和原理较为复杂，相应的洗脱方式也需随样品不同而 改变。通常可以改变缓冲液的 pH 、离子强度（例如添加 2 M NaCl）和极性（例如添加 50%乙二醇）。纯化酶时可加入低浓度的辅因子进行竞争洗脱。

4.5  再生（Regeneration）

可以采用高 pH（0.1MTris，0.5 M NaCl，pH 8.5）和低 pH（0.1MNaAc，0.5M NaCl， pH 4.5）交替清洗 4~5 次去除结合较强的蛋白质使层析柱再生。

4.6  在位清洗（CIP）

通常上述的再生过程可将填料彻底清洗。若发生柱压升高，或为了避免交叉污染， 将金属离子剥离后可进行在位清洗过程。可采用以下溶剂进行在位清洗：2 mol/L NaCl ， 1 mol/L NaOH 、70%乙醇或 30%异丙醇等。在位清洗可有效去除介质上的杂质，反向效 果更佳。清洗后需用 3~5  柱体积的纯水除去上述溶剂。

4.7  填料保存

填料的初始保存液为 20%乙醇，0.1 mol/L KH2PO4，pH 8.0。使用过后可继续相同的 溶液保存。保存温度在 2~8 ℃为宜，不可冻存。