3 、使用方法参考

3.1  色谱柱装填

以下阐述与层析系统连接时，填料的色谱柱装填方法。

（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体最好做脱气处理。

（2）填料用量计算：通过沉降定量填料体积，需要的沉降填料体积=柱体积×压缩 比（也称压缩因子）。沉降体积是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的稳定 体积。NuPerley rat-PA 的压缩比为 1.10。为使达到装柱比，可通过柱头下压的方法，也 可以通过高流速压柱。

（3）填料清洗：将填料悬液充分摇匀后量取相应体积，抽滤除去液体，并用约 3 倍 填料体积的纯化水洗涤，重复 3 次，以除去保存液。

（4）装柱填料悬液准备：将填料转移到适当的容器中，加入适量的装柱液，制成 50~75 v%的装柱填料悬液，使用前搅匀。

（5）装填前准备：在清洗干净的层析柱下端加入装柱液，以除去下垫片及层析柱下 端的空气，在柱内保留少量的蒸馏水，拧紧下堵头，调整柱子使其垂直于地面。

（6）装填：将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内（必要时使用装柱器）， 为避免引入气泡，应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后， 用装柱液将装柱 器加满，拧紧装柱器上盖，将柱子与层析系统连接。

（7）压柱：使柱内填料自然沉降（或 50~150 cm/h 的低流速下沉降），待填料沉降 完全后（填料与液体的界面清晰），去除装柱器，装上上柱头，并将柱头下降至界面处； 通过高流速（推荐流速见下表，注意柱压不超过 0.3 MPa），继续压柱至界面清晰稳定， 标记界面稳定时的柱高。停泵， 打开柱头上的阀门/堵头，关闭柱底的阀门/堵头，下压柱 头至标记位置下方与压缩比对应的位置，旋紧柱头，装柱完成。装柱完成后， 需用高流 速平衡柱内的填料。

3.2  柱效测定和评价

完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用 理论塔板高度（HETP）和非对称因子（As）来评价。柱效测定可以采用丙酮或者 NaCl 作为样品进行，按照下表配制样品溶液和流动相。

根据 UV 或者电导率曲线计算理论塔板高度（HETP）、理论塔板数（N）和非对称 因子（As），公式如下：

HETP=L/N

N=5.54(VR/Wh)2 As=a/b

其中：L 为柱高；VR 为保留体积；Wh 为半高峰宽；a 为在 10%峰高处的第一个半峰宽； b 为在 10%峰高处的第二个半峰宽。

一般来说，HETP 的数值应小于填料平均粒径的三倍（即 HETP/D50<3 ，D50 为填 料的平均粒径），As 应在 0.8~1.5 之间。

3.3  平衡与上样（Equilibration & Loading）

PB 缓冲液（20 mM PB+150 mM NaCl，pH=7.0~7.4）是较为常用和通用的缓冲体系。 初始的缓冲液称为平衡缓冲液，记为缓冲液 A。

在上样前，需用缓冲液 A 在操作流速下平衡层析柱，该过程通常需要 5~10 个柱体 积的缓冲液 A，以电导、pH 等检测信号参数不变且与缓冲液 A 对应为准。

上样量可按“mg  目标蛋白/mL  填料”来设定，通常为 DBC10% 的 50~80%，例如  NuPerley rat-PA 产品对人 IgG 的 DBC10%为~45 mg/mL，上样量可控制为 23~36 mg/mL。 在条件筛选阶段，也可以降低上样品，观察结合、特异性和洗脱情况。上样前需要对样 品进行离心（10000 g 以上）、过滤（0.22 或 0.45 μm）处理，以免堵塞色谱柱。

上样后需要 3~10 个柱体积的缓冲液 A 再平衡层析柱。

3.4  洗脱与再生（Elution & Regeneration）

最常用的洗脱方式为 pH=3~4 的甘氨酸、柠檬酸盐或乙酸盐，该条件可基本将抗体 完全洗脱。但该 pH 较低，可能会使一些抗体失活或聚集，在条件筛选阶段可逐步降低 pH，筛选出收率可接受、抗体不失活或不聚焦的最高 pH，通常在 pH=4.5~6 时，抗体开 始被洗脱。也可以将洗脱液收集在弱碱性的缓冲液中，中和至中性，以缩短低 pH 条件 的接触时间。洗脱之后，可用5~10 个柱体积的洗脱液对色谱柱进行再生。

3.5  在位清洗（CIP）

若发生柱压升高，或有蛋白与填料强烈结合无法洗脱，或有沉淀、变性蛋白时，需 要对填料进行在位清洗，可采用以下用 0.1~0.5 M 浓度的 NaOH 去除杂质，反向清洗效 果更佳。

3.6  填料保存

填料的初始保存液为 20%乙醇，使用过后可继续用20%乙醇保存。保存温度在 2~8℃ 为宜，不可冻存。