4 、使用方法参考

 4.1  色谱柱装填

以下阐述与层析系统连接时，填料的色谱柱装填方法。

（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体最好做脱气处理。

（2）填料用量计算：通过沉降定量填料体积，需要的沉降填料体积=柱体积×压缩 比（也称压缩因子）。沉降体积是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的稳定 体积。IDANUPharose FF 的压缩比为 1.15。为使达到装柱比，可通过柱头下压的方法， 也可以通过高流速压柱。

（3）填料清洗：将填料悬液充分摇匀后量取相应体积，抽滤除去液体，并用约 3 倍 填料体积的纯化水洗涤，重复 3 次，以除去保存液。

（4）装柱填料悬液准备：将填料转移到适当的容器中，加入适量的装柱液，制成 50~75 v%的装柱填料悬液，使用前搅匀。

（5）装填前准备：在清洗干净的层析柱下端加入装柱液，以除去下垫片及层析柱下 端的空气，在柱内保留少量的蒸馏水，拧紧下堵头，调整柱子使其垂直于地面。

（6）装填：将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内（必要时使用装柱器）， 为避免引入气泡，应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后， 用装柱液将装柱 器加满，拧紧装柱器上盖，将柱子与层析系统连接。

（7）压柱：使柱内填料自然沉降（或 50~150 cm/h 的低流速下沉降），待填料沉降 完全后（填料与液体的界面清晰），去除装柱器，装上上柱头，并将柱头下降至界面处； 通过高流速（推荐流速见下表，注意柱压不超过 0.3 MPa），继续压柱至界面清晰稳定， 标记界面稳定时的柱高。停泵， 打开柱头上的阀门/堵头，关闭柱底的阀门/堵头，下压柱 头至标记位置下方与压缩比对应的位置，旋紧柱头，装柱完成。装柱完成后， 需用高流 速平衡柱内的填料。

4.2  柱效测定和评价

完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用 理论塔板高度（HETP）和非对称因子（As）来评价。柱效测定可以采用丙酮或者NaCl 作为样品进行

4.3 金属离子螯合

Ni-IDANUPharose FF 已螯合 Ni2+，用户可直接使用。IDANUPharose FF 以未螯合 金属离子的形式出售，用户可以在装柱完成后再层析柱中螯合金属离子，螯合过程参照 以下步骤。

（1）配制 50~200 mM 的金属离子溶液，例如螯合 Ni2+通常用 NiSO4 。螯合 Ni2+ 、 Cu2+、Co2+、Zn2+等不同离子的过程基本相同，需注意控制不同 pH 条件下不同金属离子 的溶解性，pH 过高可导致沉淀。螯合 Zn2+ 时，需控制 pH=5.5 或者更低；螯合 Fe3+ 时， 需控制 pH=3.0 左右。

（2）用纯水清洗色谱柱，纯水用量 3~5 CV（柱体积），流速 100~300 cm/h。

（3）用 0.2~0.8 CV 的金属离子溶液通过色谱柱，流速 50~100 cm/h，金属离子过量 50%时足够螯合完全。例如 IDANUPharoseFF 可螯合 30 μmol Ni2+/mL，用 0.5 CV 的 100 mM NiSO4 溶液螯合时，Ni2+过量 67%。螯合完全后色谱柱底部的颜色从白色变为螯合 特定金属离子的颜色。

（4）用纯水清洗色谱柱除去过量的金属离子，纯水用量至少 5 CV，流速 100~300cm/h。

（5）用 20 mM 醋酸钠+0.5 M NaCl（pH=4.0）缓冲液将螯合不稳定的金属离子除 去，缓冲液用量至少 5 CV，流速 100~300 cm/h。

（6）可直接用结合缓冲液平衡色谱柱。

在装柱前螯合金属离子的过程与上述在色谱柱中螯合一致，可在旋匀仪、反应瓶（釜） 中螯合金属离子，利用过滤器清洗螯合前后的填料。

4.4  平衡与上样（Equilibration & Loading）

金属螯合填料与磷酸盐、Tris-HCl  等缓冲体系兼容，其中“20 mM PB+500 mM NaCl （pH=7.4）”的缓冲体系最为常用。初始的缓冲液称为平衡缓冲液， 记为缓冲液 A。缓冲 液 A 的特点为不含或者含少量咪唑，pH 在 7~8 之间居多，呈弱碱性。实际使用过程中， 如果上样料液的体积特别大，从降低成本的角度考虑，可不往料液中添加咪唑和 NaCl 来抑制非特异性吸附，而是在上样后进行冲洗来去除杂质。

在上样前，需用缓冲液 A 在操作流速下平衡层析柱，该过程通常需要 5~10 个柱体 积的缓冲液 A，以电导、pH 等检测信号参数不变且与缓冲液 A 对应为准。

上样量可按“mg 目标蛋白/mL 填料”来设定，通常为 DBC10% 的 50~80%，例如 Ni- IDANUPharoseFF 产品对纽龙生物的重组金黄色葡萄球菌蛋白 A（r-SPA，NRPA04）的 DBC10%为~40 mg/mL，纯化 r-SPA 时的上样量可为 20~32 mg/mL。除了 DBC10%，也可 以测试上样流穿液中的目标蛋白确定上样量。上样前需要对样品进行离心（10000 g  以 上）、过滤（0.22 或 0.45 μm）处理，以免堵塞色谱柱。

上样后需要 3~10 个柱体积的缓冲液 A 再平衡层析柱。

4.5  洗杂（Wash）

  最常用的洗脱方式为提高洗脱液中咪唑的浓度（在缓冲液 A 中加入咪唑），推荐在 0~500 mM 范围内进行阶跃洗脱或者线性梯度洗脱。对于大多数带组氨酸标签的蛋白， 200 mM 的咪唑浓度可以将目标蛋白洗脱完全。对于一些场合，也可以改变 pH，结合较 弱的蛋白可在 pH 6 时可洗脱，结合较强的蛋白可在 pH 6~4 时洗脱，需注意 pH 不能低 于 4。

4.7  再生（Regeneration）

在多次使用后，需要对填料进行再生。可以选择 0.5~1 柱体积 200 mM EDTA+500 mM NaCl （pH=7）的缓冲液将金属离子剥离。再用 50~200 mM 的金属盐溶液与 IDA 配 基螯合，用纯水将过量的金属离子除去，用 20 mM 醋酸钠+0.5 M NaCl（pH=4.0）缓冲 液将螯合不稳定的金属离子除去。

对于 IDANUPharoseFF，螯合 Ni2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等不同离子的过程基本相同， 需注意控制不同 pH 条件下不同金属离子的溶解性，pH 过高可导致沉淀。螯合 Zn2+ 时， 需控制 pH=5.5 或者更低；螯合 Fe3+ 时，需控制 pH=3.0 左右。

4.8  在位清洗（CIP）

通常上述的再生过程可将填料彻底清洗。若发生柱压升高，或为了避免交叉污染， 将金属离子剥离后可进行在位清洗过程。可采用以下溶剂进行在位清洗：2 mol/L NaCl ， 1 mol/L NaOH 、70%乙醇或 30%异丙醇等。在位清洗可有效去除介质上的杂质，反向效 果更佳。清洗后需用 3~5  柱体积的纯水除去上述溶剂。

4.9  填料保存

填料的初始保存液为 20%乙醇，使用过后可继续用20%乙醇保存。保存温度在 2~30 ℃ 为宜，不可冻存。